一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用，所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区或者以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区；本发明专利技术提供的玉米转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因在受体玉米中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体玉米的农艺性状不会产生不良影响，本发明专利技术检测方法可以为利用转化事件进行育种提供分子标记，提高育种工作效率。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术属于植物分子生物学领域，特别是转基因农作物品种培育领域。本专利技术涉及具有抗虫抗草甘膦玉米转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”及其特异性检测方法。(二)
技术介绍
玉米(Zea mays)是一种重要的作物，是世界上很多地区的主要食物来源。随着植物基因工程的发展，通过导入外源基因来进行遗传改造成为遗传育种的主要手段之一。在玉米生产中，抗虫和抗除草剂都是非常需要的农艺性状。抗虫转基因玉米能够大幅度地降低化学杀虫剂的使用量，从而降低生产成本并且减少农药对环境和农作物产品的污染。抗除草剂玉米可以大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力的投入，减少杂草对玉米产量的影响。此外，利用除草剂防治杂草也更加有利于推广免耕技术，减少土壤和肥料的流失。因此抗虫和抗除草剂性能在玉米生产中具有突出的重要性。转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。目前并不清楚外源基因在植物中的插入位点整合规律，因此研发过程中需要产生大量转化体并从中筛选理想的转化事件。通常需要产生数百乃至数千的不同转化事件，并在这些转化事件中筛选出具有预期转基因表达水平和模式的单一转化事件。利用育种方法、体细胞原生质融合技术可以将该转化事件导入到不同遗传背景的玉米基因组中，从而赋予玉米抗虫抗草甘膦的能力。通过转化事件专利对转基因农作物进行知识产权保护是目前国际上通用方法，能够进入商业化的转化事件是从大量转化事件中筛选鉴定获得，外源基因与受体作物基因组特异位点整合，具有独特的分子特征，同时外源基因表达规律与生产实际需要相吻合，在基因分子特征和表达规律上都与一般转化事件不同，因此具有明显的新颖性、实用性和创造性。目前，国际上商业化的转化事件多获得知识产权保护，部分转化事件在中国申请并获得专利保护。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供优良的玉米抗虫抗草甘膦转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”，这两个独立转化事件所含外源基因的设计构思相同，是同个植物转化载体侵染玉米后，通过筛选获得的优良转化事件，这两个转化事件都可实现将外源基因引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因外源基因在受体玉米中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体玉米的农艺性状不会产生不良影响。本专利技术提供一种玉米转化事件，所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区或者以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘膦基因，所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述抗草甘膦基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。进一步，优选所述外源基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。进一步，优选所述玉米转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区，即本专利技术提供抗虫抗草甘膦玉米转化事件“双抗12-5”，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.2、插入序列左侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.1和插入序列右侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.3构成。进一步，所述玉米转化事件以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区，即本专利技术提供抗虫抗草甘膦玉米转化事件“双抗12-15”，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.2、插入序列左侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.14和插入序列右侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.15构成。本专利技术所述玉米转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”是利用农杆菌侵染法，将含有抗虫抗草甘膦基因表达框的外源T-DNA序列导入玉米细胞中，通过再生含有外源基因的玉米细胞获得玉米转基因群体，并利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到能够满足生产需要的玉米转化事件。本专利技术提供的外源T-DNA含有抗虫基因表达框和抗草甘膦基因表达框。本专利技术提供的抗虫基因表达框由玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)、抗虫融合基因cry1Ab-cry2Aj和玉米PEP carboxylase基因(pepc)终止子构成。其中玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)大小为2.1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.7，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。PEP carboxylase基因(pepc)终止子，来源于玉米，大小为0.2kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.8。进一步，所述抗虫基因是cry1Ab和cry2Aj的融合基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，其中，1-1947bp为cry1Ab的核苷酸序列；1948-1965bp核苷酸序列为CCCGGGAAGGGTGGAGGA，编码Cry1Ab和Cry2Aj之间的连接肽，连接肽序列为PGKGGG；1966-3861bp为cry2Aj改良基因的核苷酸序列。融合基因全长为3861bp，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。所编码的蛋白质由1287个氨基酸残基组成，蛋白分子量大小为142.8kDa。Cry1和Cry2是两类被广泛应用的抗虫基因，其中Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1F和Cry2Ab等在玉米、棉花中已经大规模推广应用，Cry1Ab是一种杀虫能力比较强的Bt晶体杀虫蛋白质，特别是其对玉米螟的杀虫活性尤为高。Cry2Aj对主要农作物鳞翅目害虫具有比较高的杀虫能力，与目前生产大量推广的Cry2Ab的杀虫谱比较接近，氨基酸序列也比较相似。这些基因的安全性和抗虫能力已经得到充分证明。本专利技术使用了cry1Ab和cry2Aj的融合基因，其特点是同时利用两种不同的抗虫Bt基因，并且它们在玉米中表达量相同。目前的研究认为，二个不同类型抗虫基因同时表达有可能减缓害虫抗性的发生(Zhao et al.,2003,Nat.Biotechnol.21:1493-1497)，有利于抗虫转基因玉米的长期有效利用。本专利技术提供的抗草甘膦表达框是由花椰菜花斑病病毒(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)的35S启动子和玉米polyubiquitin-1基因启动子组成的复合启动子(p35S-pZmUbi-1，核苷酸序列为SEQ ID NO.9)，5’端本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米转化事件，其特征在于所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区或者以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。

【技术特征摘要】
2015.05.22 CN 20151026704451.一种玉米转化事件，其特征在于所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区或者以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。2.如权利要求1所述的玉米转化事件，其特征在于所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘膦基因。3.如权利要求2所述的玉米转化事件，其特征在于所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。4.如权利要求2所述的玉米转化事件，其特征在于所述抗草甘膦基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。5.如权利要求1所述的玉米转化事件，其特征在于所述外源基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。6.一种权利要求1所述玉米转化事件的特异性PCR鉴定方法，其特征在于以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区，用于特异性PCR鉴定的引物：SP1：5’-TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3’；RB-Test：5’-CTCGTCATCGACCAAGTCATGAAG-3’。R1：5’-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG-3’；LB-test：5’-AAGACGTCCGGGGGAACCGTTGTTC-3’。7.一种权利要求1所述玉米转化事件的特异性PCR鉴定...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈志成，林朝阳，张先文，徐晓丽，
申请(专利权)人：杭州瑞丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33