一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术具体公开了一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT‑PCR引物和探针组合及试剂盒，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～24所示。以所述引物和探针组合为基础，结合实时定量PCR技术灵敏可靠的优势以及微列阵技术同时检测多种基因表达量的优势，开发一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT‑PCR阵列试剂盒，一次RT‑PCR反应可以同时快速检出8种虫媒脑炎病毒，以实现RT‑PCR检测多种病原体的集成化和高通量。可以应用于大规模病原体筛查，为致病性脑炎虫媒病毒感染诊断和确定感染源提供技术支持，对致病性脑炎临床防控具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疾病体外诊断领域，具体涉及一种同时检测8种脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合及试剂盒。
技术介绍
病毒感染引起的神经系统损伤已经逐渐成为临床上最常见的中枢神经系统感染性疾病，烈性脑炎病毒类、肠道病毒等多重病毒感染均可以引发不同程度神经系统症状。80％以上的中枢神经系统病毒感染是由肠道病毒(enteroviruses)引起的，包括柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、埃可病毒(ECHO virus)及脊髓灰质炎病毒(polio-virus)等。近几年，一些新发现的脑炎病毒，尤其是一系列虫媒性病毒和人畜共患性脑炎病毒以其症状复杂，诊断困难，死亡率高逐渐引起了人们的严重关注。目前的研究表明脑炎病毒感染的临床症状包括发热、头疼，咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有时还会出现腹泻和呕吐，病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可能出现意识模糊，抽搐，颈项强直，呼吸衰竭、多器官损伤，导致死亡。目前尚无特效的治疗药物以及相应疫苗。因此对于病毒性脑炎的早期快速诊断，对疾病的治疗、控制以及预防都具有重要的现实意义。虫媒病毒性脑炎是由嗜神经性虫媒病毒引起中枢神经系统疾病。嗜神经性虫媒病毒是一组以吸血昆虫为传播媒介的病毒，其中多种病毒可以造成急性脑炎，病死率高，造成严重的公共卫生问题。嗜神经性虫媒病毒主要包括：黄病毒属(flavivirus)的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBE)、西尼罗病毒(West Nile virus，WN)；甲病毒属(alphavirus)的东方马脑炎病毒(eastern equine encephalomyelitis virus，EEEV)、西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitisvirus，WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalomyelit is virus，VEEV)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)加利福尼亚脑炎病毒组(California encephalit is virus group，CEV)等，其引起的人类脑炎症状十分危急而凶险，临床表现与乙型脑炎很相似，病死率约在35％以上。是目前国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，在国内属一类管理的病毒种类，备受关注。以尼帕病毒(NipahVirus,NiV)和亨德拉病毒(HendraVirus，HeV)为代表的此类数种人畜共患性脑炎病毒，因为感染宿主多，病程猛烈迅速，致死率奇高，同样引发严重的关注。病毒性脑炎症状复杂，发病急骤，致死率高，常见混合感染的病例，尤其是与其他疾病及其他病毒引发的脑炎在早期症状上难以区别，因此在感染早期，快速、准确的进行鉴别和诊断，是虫媒病毒脑炎防控的重点。临床上脑炎病毒的检测和诊断，主要依靠流行病学资料，临床表现、脑脊液实验室检查和病毒学分析。由于其症状与化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、真菌性脑膜炎以及肠道病毒引发的脑炎非常类似，因此常规的病毒学检测，血清学检测等，由于耗时长，疾病早期灵敏性不足，以及对操作的器械，环境，操作人员技术能力的要求较高，很难在疾病发生的早期进行大规模的筛查诊断以及提供准确及时的信息，影响行政及医疗部门对疾病流行的控制。目前，对于病毒性脑炎来说，核酸诊断是最灵敏快捷的检测方法。目前应用于脑炎病毒的检测方法有RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和生物芯片等。基于PCR反应的核酸诊断方法是目前最常用的实验方法。但是PCR检测不同的病原需要根据不同的特异性引物采用不同的反应体系和反应条件。因此如果要同时进行多种病原体的筛选则工作量巨大，耗时长久。高通量大样本的快速筛选成为了临床病原监测和诊断的趋势。多重PCR也是一种能够通过在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，同时进行多种基因检测的技术。但是由于多重PCR技术存在多重引物相互影响，可能降低检测的灵敏性和特异性。在应对多重病原感染时，容易出现结果混淆，而且检测往往需要与电泳，测序，杂交等技术相联系才能获得较可信的结果，可能耗时更长，数据分析也比较复杂，目前市场上大多数的多重PCR检测，往往局限在某一种病毒或者遗传病的分型，而很少通用应用于新发突发传染病的诊断，以及大规模的病原体筛查。生物芯片是目前最常使用的高通量的核酸检测方法。其通过微电子技术将特异性的核酸和蛋白标记在硅片、玻片或者硝酸纤维膜上，通过分子杂交的方法来进行病原学检测，具有灵敏性高，通量大的优点。但是，生物芯片应用于现场和临床还有许多的实际问题，例如研究成本高，标记技术复杂，一般实验室难以承担。方法标准化存在限制，各个实验室的设备以及对样本处理的方法不同，导致结果差异巨大，很难形成数据的可比性。假阳性和假阴性结果往往影响结果的判定，生物芯片的特异性有待提高。因此，一种具有广泛适用性的，通量高，特异性，灵敏性强，可以用于大规模病原体筛查的检测方法，帮助疾病控制人员了解疾病发生的情况，及早确定感染病原。对于虫媒病毒的诊断，具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提供了一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合。本专利技术的另一个目的是提供一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR阵列试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合，所述引物和探针序列如SEQ ID NO：1～24所示，所述8种虫媒脑炎病毒为东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒。一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR阵列试剂盒，所述试剂盒含有如上SEQ ID NO：1～24所述的引物和探针组合，试剂盒还包含阳性质控品、阴性质控品和荧光定量检测试剂。优选地，所述引物和探针的浓度均为5～15pmol/μl。更优选地，所述引物的浓度为10pmol/μl，所述探针的浓度为5pmol/μl。优选地，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为含有东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒等8种虫媒脑炎病毒检测靶标序列的重组假病毒。更优选地，将需要检测的8种虫媒脑炎病毒的靶标序列按EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV排列顺序全部组合在一条基因链上，将该基因链整合到假病毒中，得到阳性质控品。更优选地，所述阳性质控品的浓度为1×106拷贝数/ml。制备阳性质控品中使用的假病毒是通过市售的逆转录病毒包装系统构建而成。相对于利用质粒DNA作为阳性模版的标准品来说，由逆转录病毒构建的阳性指控品完全模拟了实际情况，为衣壳和包膜包裹的RNA片段，可以为实验的全过程，包括病毒核酸的提取，RNA至DNA的逆转录，以及最后的核酸扩增进行阳性参照。优选地，所述试剂盒由以下成分组成：一步法RT-PCR反应缓冲液，一步法RT-PCR反应酶混合液，SEQ ID NO：1～24所述的引物和探针组合，96本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT‑PCR引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针序列如SEQ ID NO：1～24所示，所述8种虫媒脑炎病毒为东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针序列如SEQ ID NO：1～24所示，所述8种虫媒脑炎病毒为东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒。2.一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR 阵列试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和探针组合，还包括所述试剂盒检测所需的阳性质控品、阴性质控品和荧光定量检测试剂。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针浓度均为5～15 pmol/μl。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物浓度为10pmol/μl，所述探针浓度为5pmol/μl。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有8种虫媒脑炎病毒检测靶标序列的重组假病毒。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品浓度为1×106 拷贝数/ml。7. 根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑶，吴英松，李明，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44