快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用，涉及南瓜杂交种的纯度鉴定技术领域。该方法包括以下步骤：A、提取南瓜杂交种子的DNA；B、以提取的DNA作为模板，配制聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；C、将PCR扩增产物进行电泳分离；D、根据电泳分离出的条带，计算种子纯度。本发明专利技术能够将现有的PCR所需时间缩短75.7％，大幅提高SSR方法测定种纯的速度，能够满足大批量生产，且无需使用昂贵进口仪器，从而大幅降低早期投入与后期生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及南瓜杂交种纯度鉴定
，具体涉及一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用。
技术介绍
目前，我国农作物杂交种的纯度需达到或超过法律规定的比例方可上市销售。为检验杂交种的纯度，现有大致三种方法：a.包括田间小区种植检验法在内的形态检验法；b.包括同工酶电泳法在内的蛋白质电泳技术检验法；c.包括SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)分子标记技术在内的DNA分子标记检验法。其中，SSR分子标记检验法因其重复性和稳定性优异，而在近年来应用得越来越广泛。SSR又称微卫星序列，是指真核生物的基因组中散布的大量串联重复序列，其中2-4个碱基对长度的短重复序列在不同品种之间具有高度多态性，而这种SSR在结构上的最大特点是两端的序列保守，因此可设计与两端保守序列互补的引物，对SSR进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增，来揭示不同品种间SSR序列长度的多态性。这其中的PCR步骤需使用到PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物A、引物B和DNA模板在内的6种组分，目前已有许多研究者进行过对各组分用量的优化尝试，以期降低PCR步骤中的试剂成本。但当这一技术被研究机构或企事业单位应用到大批量生产实践中时，除经济成本外，往往也期望能控制时间成本。以当下普遍使用的标准PCR程序为例：94℃预变性3min，(94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s)，35个循环，72℃延伸10min，此扩增条件运行一次耗时约为1小时43分钟。以一天8小时工作制计，一台PCR仪仅可运行4.7次，以一块96孔PCR板检测96个样品计，一天可检测451个样品。再以一个批次的种子需检100粒计，即一天检4.5个批次。这对于种子大量生产的旺季期内几千个批次的检验需求来说，无疑杯水车薪。为解决这一问题，目前已有国外厂商推出快速PCR仪，通过加快升降温速度来缩短一次PCR运行所需的时间。然而这样一台PCR仪比之普通型号的PCR仪要贵很多，普通PCR仪约4万多，而快速PCR仪需12万左右，因为它的加热模块使用的是世界上导热效果最好的金属-黄金。而且，使用快速PCR仪时，如想达到最佳效果，还需配套使用较贵的特殊设计的PCR板，不利于大批量生产中的成本控制。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服上述
技术介绍
的不足，提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用，本专利技术能够将现有的PCR所需时间缩短75.7％，大幅提高SSR方法测定种纯的速度，能够满足大批量生产，且无需使用昂贵进口仪器，从而大幅降低早期投入与后期生产成本。本专利技术提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：A、选取南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；B、以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；C、将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；D、选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。在上述技术方案的基础上，所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，33～35个循环。在上述技术方案的基础上，选取的南瓜品种为早蜜本品种时，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示。在上述技术方案的基础上，步骤A的具体操作如下：A1、选取至少100粒的南瓜杂交种子，浸种4小时，然后催芽36小时；A2、选取健康的芽根作为提取材料，每个芽根截取1cm放入一个离心管中；每个离心管的处理如下：将2×CTAB提取缓冲液预热至65℃后，取800μL提取缓冲液加入离心管中；使用磨样机磨碎材料，65℃水浴40min，水浴过程中摇匀离心管；向离心管中加入与提取缓冲液等体积的氯仿，摇匀，静置10min；将离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min；另取一个干净的离心管，吸取上清液到该离心管中，再向该离心管中加入400μL预冷的异丙醇，在-20℃的温度下放置1小时；将该离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，加入70％乙醇洗涤沉淀后，除去上清液；烘干该离心管，加入40μL水溶解该离心管内的沉淀，得到南瓜杂交种子的DNA溶液。在上述技术方案的基础上，聚合酶链式反应PCR体系包括：含Mg2+的10×PCR缓冲液、浓度为1mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP、浓度为0.5μmol/L的正向SSR引物、浓度为0.5μmol/L的反向SSR引物、2.5ng/μL的DNA、0.025U/μL的Taq DNA聚合酶、双蒸水。在上述技术方案的基础上，步骤C的具体过程如下：配制浓度为3％的琼脂糖凝胶，制作胶板；将所有PCR扩增产物分别点样后，120V电压条件下电泳45分钟，电泳结束后，将胶板放入凝胶成像系统中拍照保存。在上述技术方案的基础上，步骤D中，所述判断杂交种、父本、母本的具体过程如下：电泳分离出的条带中，父本、母本分别有不同的带型，而子一代杂交种有父母本两条带；如电泳分离出的条带为双条带，则判定该种子为子一代杂交种，如为母本型条带则判定该种子为母本，如为父本型条带则判定该种子为父本。本专利技术还提供上述的方法在早蜜本品种的南瓜杂交种纯度鉴定中的应用，包括以下过程：选取早蜜本南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示；所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，35个循环，得到PCR扩增产物；将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。与现有技术相比，本专利技术的优点如下：1、自从1985年PCR作为一种专利所属的生物技术面世以来，科研工作者长期依赖于标准的PCR程序进行实验，即94℃预变性3min，(94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s)，35个循环，72℃延伸10min。该标准程序中使用的时间长度，在各地不同的实验室内也几乎不做大幅度的更改。而本专利技术的目的正是要打破这种常规思路，大大压缩运行一次PCR所需的时间。本专利技术将PCR程序中各个温度下的温育时间经过调整，改为(94℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s)，33～35个循环，并配合简单快捷的琼脂糖凝胶电泳进行检测，提高了整套种纯鉴定程序的速度。针对缩短PCR时间这一需求，目前已有厂商推出昂贵的快速PCR仪和配套使用的特殊耗材，而本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、选取南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；B、以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；C、将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；D、选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、选取南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；B、以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；C、将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；D、选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。2.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，33～35个循环。3.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于：选取的南瓜品种为早蜜本品种时，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示。4.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，步骤A的具体操作如下：A1、选取至少100粒的南瓜杂交种子，浸种4小时，然后催芽36小时；A2、选取健康的芽根作为提取材料，每个芽根截取1cm放入一个离心管中；每个离心管的处理如下：将2×CTAB提取缓冲液预热至65℃后，取800μL提取缓冲液加入离心管中；使用磨样机磨碎材料，65℃水浴40min，水浴过程中摇匀离心管；向离心管中加入与提取缓冲液等体积的氯仿，摇匀，静置10min；将离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min；另取一个干净的离心管，吸取上清液到该离心管中，再向该离心管中加入400μL预冷的异丙醇，在-20℃的温度下放置1小时；将该离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，加入70％乙醇洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴祖云，高秀武，王雯雯，赵传奇，
申请(专利权)人：安徽江淮园艺种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34