一种利用数字PCR检测圆环病毒2型病毒含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用液滴式数字PCR检测样品中圆环病毒2型病毒含量的方法和试剂盒，属病毒检测技术领域。该方法包括1)圆环病毒基因组DNA的提取；2)ddPCR反应体系的配置，进行数字PCR反应；3)根据反应的信号，对检测结果进行判读。本方法无需设置标准曲线，根据检测结果可直接得出样品中圆环病毒2型基因组DNA拷贝数，实现了核酸拷贝数的绝对定量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因领域，涉及一种病毒核酸定量的方法，特别涉及一种利用数字PCR检测圆环病毒2型核酸含量的方法。
技术介绍
猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(PCV)引起的猪的一种多系统功能障碍性疾病，临床上以新生仔猪先天震颤和断奶仔猪多系统衰弱综合症为主要症状。猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，是最小的动物病毒之一。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。针对PCV2的鉴定和检测已经有许多方法，如电镜观察、ELISA、IFA、PCR、荧光定量PCR(qPCR)等，在上述方法中qPCR技术具有快速、灵敏、高特异性等特点，因此被越来越多的应用于各种病毒的检测。但是，qPCR的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。数字PCR(PCR(digitalpolymerase chain reaction，dPCR)是一项检测和定量核酸的新技术。20世纪末，Vogelstein等提出dPCR的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与qPCR不同的是，dPCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度(含量)能够将误差控制在5％以内，dPCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。由于dPCR是一项具有可重复性的定量微量DNA分子的优良技术.其操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点使其成为了分子生物学研究中的重要工具，并已经应用于单细胞分析、癌症早期诊断和产前诊断、疫病检测等研究领域。将dPCR技术用于PCV2的检测，可以快速、准确的对PCV2核酸进行绝对定量。
技术实现思路
：本专利技术的目是提供一种利用数字PCR检测样品中PCV2核酸浓度的试剂盒及方法。数字PCR方法在动物疫病检测、疫苗生产质量控制中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术是一种高灵敏度的检测圆环病毒2型的方法，步骤包括：(1)样品中病毒DNA的提取，获得PCR扩增模板；(2)数字PCR反应体系的配置，进行dPCR反应；所述PCR反应体系中含有步骤(1)获得的PCR扩增模板、PCV2特异引物对、探针、dNTP和DNA聚合酶；(3)根据步骤(2)dPCR反应产生的荧光信号，计算得到所述待测样品中的PCV2拷贝数；在上述方法中，所述待测样品可以为组织病料、也可以是病毒细胞培养物。在本专利技术的实施例中，所述待测样品为组织病料，具体为猪淋巴结、脾和肾脏；(4)当所述待检样品为组织病料时，上述方法的步骤(1)中，所述“病毒DNA的提取”可为将所述待测样品(组织病料)进行研磨匀浆，冻融3次。将所述待测样品(组织病料)8000～14000g离心1～5min，温度可为4℃。取上清液，采用商品化病毒DNA提取试剂盒进行核酸提取。当上述样品为血液、组织液、尿液等液体样品时，上述方法步骤(1)中，所述“病毒DNA的提取”可为8000～14000g离心1～5min，采用商品化病毒DNA提取试剂盒进行核酸提取。在上述的检测方法的步骤(2)中，进行所述数字PCR反应时的退火温度可为53℃。进一步，在本专利技术中，进行所述数字PCR反应时的反应程序为：95℃10min；94℃30s，53℃60s，40个循环；98℃10min。PCR仪升降温速度设定为≤2.5℃。在上述的检测方法的步骤(2)中，所述最佳反应体系为2×ddPCR supermix for probe 10uL，上下游引物各100-900nmol/L，探针100-900nmol/L，模板DNA(cDNA)小于200ng，补灭菌水至总体积20uL；在上述的检测方法的步骤(2)中，所述PCV2引物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子引物对，探针为序列表中序列3所示的1条单链DNA分子。在上述方法中，所述的探针的荧光基团选自6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光数(HEX)，Cy5(美国Life Technologies)、Cy3(美国Life Technologies)、VIC(美国Life Technologies)，荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基若丹明(TAMARA)、BHQ1(美国Life Technologies)、BHQ2(美国Life Technologies)或MGB(美国Life Technologies)。在上述方法中，进行所述数字PCR反应，并根据产生的荧光信号计算所述待测样品中PCV2核酸拷贝数。首先，利用数字PCR系统的微滴发生器将配置好的反应体系进行分液处理，生成10000～20000个油包水的反应液滴，使每个微滴的PCR扩增模板数少于或者等于1个；其次，进行PCR循环扩增并进行结果判断：对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据液滴中有荧光信号的液滴数量确定PCV2DNA模板的数量。可用QuantaSoft(Bio-Rad)软件进行数据分析，计算样品中病毒的核酸拷贝数。通过上述方法，可以检测PCV2的病毒核酸拷贝数。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用数字PCR技术检测PCV2病毒，其检测的灵敏度略高于荧光定量PCR技术；而且本方法不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接判读样品中PCV2的核酸拷贝数，极大的简化了操作步骤。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中：图1dPCR退火温度优化结果(A～H依次为61℃～51℃)图2dPCR各浓度梯度检测结果。标准品浓度为4.85×103copy/ul、4.85×102copy/ul、4.85×101copy/ul、4.85×10-1copy/ul、2.43×10-1copy/ul、1.21×10-1copy/ul、6.06×10-2copy/ul。图3dPCR各浓度梯度检测结果线性关系图。具体实施方式：下面结合附图和具体实例对本专利技术做进一步说明，但不作为对本专利技术的限定。1.主要试验仪器CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)；水平电泳及凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)；梯度PCR扩增仪(Bio-Rad公司)；超微量分光光度计；QX-i00微滴式数字PCR仪(Bio-Rad公司)；Thermo核酸提取仪；培养箱；低温冰箱；恒温循环水浴槽；高速冷冻离心机；常温离心机；2 试验材料和试剂病毒DNA/RNA磁珠法提取试剂盒(成都拓洋科技有限公司)；2×Premix Ex Taq Probe qPCR(TakaRa公司)；2×SsoFastTMProbes Supermix(美国伯乐公司)；DNA分子量标准、琼脂糖(宝生物工程(大连)有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。圆环病毒疫苗株由四川华派生物技术公司提供。引物和探针送上海基康生物科技有限公司合成，见下表。名称序列长度bpSeq 1CGCTGGAGAAGGAAAAATGG20Seq 2CTTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
数字PCR方法在定量检测圆环病毒2型病毒含量中的应用。

【技术特征摘要】
1.数字PCR方法在定量检测圆环病毒2型病毒含量中的应用。2.一种利用数字PCR检测圆环病毒2型病毒含量的方法，包括如下操作步骤：(1)提取圆环病毒DNA，获得PCR扩增模板；(2)配置PCR反应体系，进行数字PCR反应；所述数字PCR反应体系中包含步骤(1)获得的PCR扩增模板、圆环病毒检测引物对、荧光探针、dNTP和DNA聚会酶；(3)根据步骤(2)数字PCR反应产生的荧光信号，计算得到所述待测样品中的圆环病毒数量。3.根据权利2所述的方法，其特征在于：所述圆环病毒引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子以及序列3所示的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：林华，陈世界，杨苗，肖艳，孙颖杰，严玉宝，胡娟，赵珊，薛昌华，
申请(专利权)人：四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心，成都大学，
类型：发明
国别省市：四川;51