用于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片制造技术

本发明专利技术提供一种用于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微流体通道层、带有微孔阵列的基板以及带有腔体组的底板。本发明专利技术还提供一种与所述芯片配套的用于EGFR基因多个突变位点单细胞水平检测的系统。本发明专利技术的微流控芯片及其相应的检测系统可以快速、简便和廉价的从大量细胞中分选出目的细胞，并对其中的单个细胞进行EGFR多基因位点分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微流控芯片
，具体地说，涉及一种方于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片。
技术介绍
近年来，肺癌的发病率和死亡率迅速上升，成为中国第一大癌症，虽然治疗技术有了很大提高，但5年的生存率并没有明显改善。在肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)最为代表性，占80％左右。目前，针对EGFR的靶向治疗成为人们研究的热点，并且起到了很好的疗效。EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。目前已证实，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。由于EGFR络氨酸激酶是信号传导的必要条件，因此也成为肿瘤治疗的重要靶分子。通过选择性的酶抑制剂或者单克隆抗体竞争性结合细胞外配体结合位点来阻断络氨酸激酶活化，从而抑制EGFR的激活。而目前的研究主要是针对EGFR的第18、19、20和21外显子进行。自从2004年发现上皮生长因子受体(EGFR)基因活化突变(以Del19或L858R为主)与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗非小细胞肺癌的疗效相关以来，已有多项前瞻性临床研究证实，EGFR活化突变阳性的NSCLC患者对EGFR-TKI的反应率显著高于EGFR野生型NSCLC患者，无进展生存(PFS)期和总生存(OS)期也显著延长。因此，在临床中也开始基于病人EGFR突变检测进行精准治疗。但是由于检测方法的灵敏度不够以及分选技术的限制，长期以来EGFR基因突变分析只能进行细胞群体分析。有研究表明，不同细胞之间的基因也存在差异尤其是在癌细胞中。而通过细胞群体分析获得的统计平均结果,掩盖了单个细胞之间的差异并且会受到大量非目的细胞的影响，使生物学及医学等很多领域的发展受到限制。传统的EGFR检测多集中在蛋白水平，如以免疫组化(IHC)和酶联反应吸附(ELISA)为代表的检测方法。但是上述两种方法只能大致反应EGFR蛋白的表达情况，并不能直接检测基因的突变信息，无法直接指导靶向用药。因此，一大批直接检测基因突变的技术也用于EGFR突变检测中，包括基因扩增后直接测序法(DS)、突变富集PCR法、扩增阻碍突变系统(ARMS)法、蝎形探针扩增阻滞突变系统(SARM)法、集落杂交法(CH)等。但这些技术也只是反应样本群体信息，无法在单个细胞水平上进行检测。由于细胞极小,直径一般为5-500μm,体积为fL至nL级,组分含量少(fmol至zmol)、种类繁多,使得获取操纵、扩增和分析单细胞的难度很大。在单细胞样品的处理过程中也很容易造成样品的遗失和损失，对后续分析造成影响，成功率较低。由于单细胞DNA的数量极其微小，对其分析之前必须进行DNA的扩增。而基于热循环以PCR(聚合酶链式反应)为基础的全基因组扩增技术，PCR过程中，在起始样本非常稀少时，会向序列中引入很多错误和非特异性扩增产物，使扩增质量大大降低，并且一次只能通过特定引物对单个基因位点进行检查，无法对同一样品进行多位点基因扩增。目前已公开的技术中，均没有涉及高度集成针对EGFR肿瘤细胞筛选、鉴定、裂解，扩增和多基因位点分析的，从而实现对肿瘤细胞进行单细胞水平上的多位点EGFR基因突变检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片。本专利技术的另一目的是提供一种用于EGFR基因多个突变位点单细胞水平检测的系统。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的一种用于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微流体通道层、带有微柱和微孔阵列的基板以及带有腔体组的底板；所述顶盖上设有一个样品入口、一个样品出口以及一个废液口；所述样品入口与微流体通道层的U形主流道上的样品进入口连通，所述样品出口与微流体通道层的U形主流道上的样品流出口连通，所述废液出口与微流体通道层的分支流道上的废液口连通；所述微流体通道层上设有一条U形主流道，U形主流道的一端设有样品进入口，另一端设有样品流出口；带有样品进入口一侧的主流道的前段较宽，设有过滤区，用于过滤样品，除去较大杂质；主流道的中段是分选区，用于分离肿瘤细胞；带有样品流出口一侧的主流道的后段较窄，设有捕获区，用于限定液体流动进行单细胞捕获；主流道上还设有一条与分选区垂直设置的分支流道，分支流道的另一端设有废液口，其与顶盖上的废液出口连通，用于废液的流出(如图1所示，水平宽度不同的单条流道，左边的上下两端分别作为入口和出口，右边为废液口)；所述主流道的过滤区，分选区以及捕获区分别位于基板上的过滤区、分选区和捕获区上方；样品在基板上流动，流道用于限制流体样品的运动方向；所述带有微柱和微孔阵列的基板上设有过滤区、分选区和捕获区；过滤区由间距渐变的排状分布的微柱阵列组成；分选区由大小和间距统一的微柱阵列组成；捕获区带有微孔阵列，所有微柱和微孔的位置与相应的微流体通道层上各分区相匹配，即过滤区的微柱阵列设置在微流体通道层的主流道过滤区下方，分选区的微柱阵列设置在微流体通道层的主流道分选区下方，捕获区的微孔阵列设置在微流体通道层的主流道捕获区下方(图1)，微孔的内部设有电极，阴极和阳极成对设置在微孔侧壁上；每个微孔具有与下层底板相连通的通道(即连通孔)；每个分区由流道相连接，在流体的作用下依次进入过滤区、分选区和捕获区；所述带有腔体组的底板上设有多个腔体，每个腔体由收集腔和扩增腔组成，收集腔通过连通孔与基板捕获区对应的微孔相连，用于分开收集不同微孔中的细胞裂解液；收集腔和扩增腔之间用可以控制开关的微阀连接；扩增腔内预置有多重置换扩增(MDA)试剂和/或PCR扩增试剂，用于扩增细胞裂解液中的DNA以及检测EGFR基因上的多个突变位点。所述微流体通道层上设有的通道深度为10～200微米，主流道过滤区宽度为1～10毫米；主流道分选区宽度为1～10毫米，主流道捕获区宽度为10～5000微米。流道(即微流体通道)过滤区、分选区和捕获区的长度与对应基板上各分区的长度相匹配。优选地，过滤区、分选区长度为1000～22000微米，捕获区长度为1000～42000微米。所述带有微柱和微孔阵列的基板，其每个微孔中的电极可以分别控制其是否通电。所述带有微柱和微孔阵列的基板，过滤区的微柱阵列由直径为5～200微米，高为10～200微米的圆柱排状分布组成，其微柱阵列的间距渐变，为50～500微米；分选区的微柱阵列由直径为5～50微米，高为10～200微米的圆柱排状分布组成，微柱间距为10～200微米；捕获区的微孔深度为5～100微米，是边长为5～100微米的正方形或长方形，或直径为5～100微米的圆形。所述微孔阵列，其每个微孔与下层腔体相连通的通道(连通孔)直径为1～10微米。优选地，基板的过滤区、分选区长度为1000～20000微米，捕获区的长度为1000～40000微米。所述带有腔体组的底板，其腔体组数量可变，可以多个微孔对应一个腔体，也可以每个腔体本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微流体通道层、带有微柱和微孔阵列的基板以及带有腔体组的底板；所述顶盖上设有一个样品入口、一个样品出口以及一个废液口；所述样品入口与微流体通道层的U形主流道上的样品进入口连通，所述样品出口与微流体通道层的U形主流道上的样品流出口连通，所述废液出口与微流体通道层的分支流道上的废液口连通；所述微流体通道层上设有一条U形主流道，U形主流道的一端设有样品进入口，另一端设有样品流出口；带有样品进入口一侧的主流道的前段较宽，设有过滤区，用于过滤样品，除去较大杂质；主流道的中段是分选区，用于分离肿瘤细胞；带有样品流出口一侧的主流道的后段较窄，设有捕获区，用于限定液体流动进行单细胞捕获；主流道上还设有一条与分选区垂直设置的分支流道，分支流道的另一端设有废液口，其与顶盖上的废液出口连通，用于废液的流出；所述主流道的过滤区，分选区以及捕获区分别位于基板上的过滤区、分选区和捕获区上方；所述带有微柱和微孔阵列的基板上设有过滤区、分选区和捕获区；过滤区由间距渐变的排状分布的微柱阵列组成；分选区由大小和间距统一的微柱阵列组成；捕获区带有微孔阵列，所有的微柱和微孔设置在相应的微流体通道层下方，微孔的内部设有电极，阴极和阳极成对设置在微孔侧壁上；每个微孔具有与下层底板相连通的通道；所述带有腔体组的底板上设有多个腔体，每个腔体由收集腔和扩增腔组成，收集腔通过连通孔与基板捕获区对应的微孔相连，用于分开收集不同微孔中的细胞裂解液；收集腔和扩增腔之间用微阀连接；扩增腔内预置有多重置换扩增试剂和/或PCR扩增试剂，用于扩增细胞裂解液中的DNA以及检测EGFR基因上的多个突变位点。...

【技术特征摘要】
1.用于表达EGFR的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的四层结构，由上至下分别为顶盖、微流体通道层、带有微柱和微孔阵列的基板以及带有腔体组的底板；所述顶盖上设有一个样品入口、一个样品出口以及一个废液口；所述样品入口与微流体通道层的U形主流道上的样品进入口连通，所述样品出口与微流体通道层的U形主流道上的样品流出口连通，所述废液出口与微流体通道层的分支流道上的废液口连通；所述微流体通道层上设有一条U形主流道，U形主流道的一端设有样品进入口，另一端设有样品流出口；带有样品进入口一侧的主流道的前段较宽，设有过滤区，用于过滤样品，除去较大杂质；主流道的中段是分选区，用于分离肿瘤细胞；带有样品流出口一侧的主流道的后段较窄，设有捕获区，用于限定液体流动进行单细胞捕获；主流道上还设有一条与分选区垂直设置的分支流道，分支流道的另一端设有废液口，其与顶盖上的废液出口连通，用于废液的流出；所述主流道的过滤区，分选区以及捕获区分别位于基板上的过滤区、分选区和捕获区上方；所述带有微柱和微孔阵列的基板上设有过滤区、分选区和捕获区；过滤区由间距渐变的排状分布的微柱阵列组成；分选区由大小和间距统一的微柱阵列组成；捕获区带有微孔阵列，所有的微柱和微孔设置在相应的微流体通道层下方，微孔的内部设有电极，阴极和阳极成对设置在微孔侧壁上；每个微孔具有与下层底板相连通的通道；所述带有腔体组的底板上设有多个腔体，每个腔体由收集腔和扩增腔组成，收集腔通过连通孔与基板捕获区对应的微孔相连，用于分开收集不同微孔中的细胞裂解液；收集腔和扩增腔之间用微阀连接；扩增腔内预置有多重置换扩增试剂和/或PCR扩增试剂，用于扩增细胞裂解液中的DNA以及检测EGFR基因上的多个突变位点。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流体通道层上设有的通道深度为10～200微米，主流道过滤区宽度为1～10毫米；主流道分选区宽度为1～10...

【专利技术属性】
技术研发人员：李仁，周明行，胡志远，魏泽文，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，北京泛嘉远杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11