一种用于抗肿瘤药物筛选系统的三维细胞培养基质及其制备技术方案

本发明专利技术公布了一种新型的用于肿瘤细胞三维培养的基质，该种基质可用于包裹肿瘤细胞进行三维培养，从而进一步进行抗肿瘤药物的筛选。其制备是通过海藻酸钠溶液、透明质酸钠溶液及细胞外培养基质Matrigel以适当的比例混合，然后包裹细胞。海藻酸钠可直接包裹细胞，但不利于肿瘤细胞的增殖和分化，而Matrigel作为一种较理想的细胞三维培养基质但其价格昂贵机械强度差，不利于抗肿瘤药物筛选及药理研究。本发明专利技术改善了基质的机械性能，同时有效促进体外培养细胞组织结构的形成，减少甚至替代Matrigel的使用，大大降低了肿瘤细胞三维培养的成本，便于对三维细胞进行异种移植和动物实验，且制作方法简单，实用性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于肿瘤细胞三维培养的生物材料，具体涉及海藻酸钠、透明质酸钠和Matrigel以适当浓度和比例组成的细胞三维培养基质。
技术介绍
癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病，世界卫生组织估计2008年全球有760万癌症病人死亡，中国有196万人，占全球癌症死亡人数的25.89％。全国第3次死因回顾抽样调查数据显示，随着我国卫生事业的发展和医疗技术水平的不断提高，某些疾病如急性传染病、母婴疾病等已得到了明显有效的控制，恶性肿瘤死亡率则呈明显上升趋势，已经成为影响我国居民健康的主要的死亡原因之一。世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球人口80亿，癌症新发病例将达到2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为新世纪人类的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题之一。因此，采取有效的手段研究和开发抗肿瘤药物就显得极其重要了。在药理实验中，二维细胞实验是最常用的。然而，二维细胞培养并不能逼真地模拟细胞在体内生长的微环境，进而导致二维培养的细胞与体内细胞在细胞形态学、增殖和分化能力、细胞活力、基因和蛋白的表达水平、对外界的应激能力和药物的代谢等都存在较大的差异，这极大地限制了遗传学的发展。而在新药研发方面，通过体外细胞筛选的药物往往容易出现假阳性。随着细胞培养技术的发展，细胞三维培养技术日趋成熟，已在药物筛选和药理研究方面表现出良好的作用。该技术与单层细胞相比，其药物体外筛选结果更能与动物体内实验结果相符合。实验研究发现，抗肿瘤药物及药理研究的过程中，采用三维培养技术对药物筛选可提高与动物体内的实验效果的一致性，尤其经多次改进后研发的带血液循环仿组织的肿瘤细胞培养技术，可进一步提高体外体内实验的一致性。因此，采用该仿组织三维细胞培养技术，进行体外肿瘤药物药敏快速准确筛选，对恶性肿瘤个性化给药治疗具有重要的科学意义和应用价值。基质覆盖培养模型是目前细胞三维培养模型之一，所谓基质覆盖培养是指在细胞培养器的底部覆盖一层胶原形成基底胶，使细胞在基底胶中生长，分化，形成三维结构。基质覆盖培养模型的实质是模拟细胞生长的外环境(ECM)，使细胞生长在与体内相似微环境中。体内细胞生长在被ECM围绕的三维细胞中，其它的细胞浸润在血清和组织液中，血清和中含有可以促进成纤维细胞繁殖的因子，并且可将组织内稳态从正常的分化功能转移成典型的伤口治疗反应。该方法适合在普通实验室中进行，具有广泛的应用性。然而，目前较为成熟和常用的细胞三维培养基质Matrigel其价格昂贵，且机械性能较差，会造成实验成本居高不下且不利于三维培养细胞动物实验异种移植，这不利于细胞三维培养技术的推广应用。为了解决这一问题，通过海藻酸钠溶液、透明质酸钠溶液及细胞外培养基质Matrigel以适当的比例混合，改善了基质的机械性能，同时有效促进体外培养细胞组织结构的形成，减少甚至替代Matrigel的使用， 大大降低了肿瘤细胞三维培养的成本，便于对三维细胞进行异种移植和动物实验，且制作方法简单，实用性强。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了减少甚至替代Matrigel在细胞三维培养中的使用，降低成本的同时达到理想的效果，同时增强细胞三维培养基质的性能，使其能直接接种到动物体内培养，减少实验的步骤和繁琐。本专利技术的技术方案一种用于抗肿瘤药物筛选系统的细胞三维培养基质的制备，采用中等粘度的藻朊酸盐溶于HEPES缓冲液中，高压蒸汽灭菌然后过滤处理。将2％藻朊酸盐溶液、透明质酸钠溶液和matrigrl以适当的比例混合(冰上操作)，最后与细胞悬浮液混合，混匀后，放置4℃10min，将混合液滴入0.1M CaCl2溶液中，两者交联形成乳白色的包裹有细胞的小珠。上述的一种用于肿瘤细胞三维培养的基质的制备和使用方法，具体包括如下步骤：(1)制备过程中所用溶液的配制0.1M CaCl2溶液的配制称取5.5g CaCl2固体溶解于500ml去离子水中，搅拌溶解，用0.22μm滤器过滤，得到无菌的CaCl2溶液。0.15M NaCl-0.025M HEPES溶液的配制称取8.775g氯化钠和5.958g HEPES同时溶解于1L去离子水中，搅拌溶解，用0.22μm滤器过滤，得到无菌的0.15M NaCl-0.025M HEPES溶液的配制。2％藻朊酸盐溶液的配制称取1g藻朊酸钠粉末边搅拌边缓慢加入50°水浴加热的0.15M NaCl-0.025MHEPES溶液中，高压蒸汽加热，自然冷却至室温，用0.22μm滤器过滤。10mg/ml透明质酸钠溶液的配制称取200mg透明质酸钠粉末，加入20ml磷酸盐缓冲液(PH7.4)，过夜，用0.22μm滤器过滤。(2)用混合凝胶包裹细胞在冰上将matrigel与10mg/ml的透明质酸钠溶液及2％中等粘度的藻朊酸钠以一定的比例配比，形成混合凝胶，再与适当浓度和体积的细胞悬液混合，然后冰上静置10min以消除气泡。最终使Matrigel的含量为8％-23％(v/v)，透明质酸钠的终浓度为2-8mg/ml，藻朊酸钠的终浓度为0.3％-1.5％。最后，将混有细胞的凝胶混合液悬滴滴入0.1M CaCl2溶液中，静置10-20min，形成乳白色的藻朊酸盐小珠。将乳白色小珠用经过灭菌的小勺移至磷酸盐缓冲液和无血清培养基中各洗涤一次，每次3min。最后，移入培养皿中加入新鲜的完全培养基培养。上述制备过程中，matrigel、透明质酸钠和藻朊酸钠的含量和比例要适当，若matrigel和透明质酸钠的含量过高则会大大增加成本，若含量过低则细胞无法生长成与二维细胞明显不同的三维结构。若藻朊 酸钠的含量直接影响包裹有细胞的乳白色藻朊酸盐小珠的机械性能，过高小珠易破裂，无法为细胞的生长提供支架，过低则小珠的刚性有余而柔性不足，小珠易粉碎。matrigel、透明质酸钠和藻朊酸钠之间的配比是制成上述一种适合肿瘤细胞三维培养基质的关键。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术采用透明质酸钠和藻朊酸钠生物相容性好，对细胞无毒副作用，对人和环境友好，并且价格较低，大大降低了细胞三维培养的成本。(2)本专利技术采用matrigel、透明质酸钠和藻朊酸钠以适当的比例配比所形成的细胞三维培养基质，达到良好的细胞三维培养效果，适合多种肿瘤细胞的三维培养，应用范围广。(3)本专利技术采用matrigel、透明质酸钠和藻朊酸钠以适当的比例配比所形成的细胞三维培养基质包裹细胞后滴入氯化钙溶液中形成的乳白色小珠机械性能好，易于进行动物实验异种移植，并且回收细胞方便，易于对三维培养的细胞进行后续分析。(4)本专利技术所述的制备过程简单易控，重复性好。附图说明图1PC3 cells在细胞三维培养基质条件下14天后石蜡切片H.E.染色，显微镜观察。图2PC3 cells在二维培养条件下，显微镜观察。图3DU145 cells在细胞三维培养基质条件下14天后石蜡切片H.E.染色，显微镜观察。图4DU145 cells在二维培养条件下，显微镜观察。图5是PC3细胞在本专利技术所述的三维培养基质培养14天后的石蜡切片的N-Cadherin免疫荧光染色图片，而图5-1和图5-2分别是PC3细胞在本专利技术所述的三维培养基质培养14天后的石蜡切片N-Cadherin免疫荧光染色而无核染的图片及只有核染无N-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞三维培养基质，其特征在于，可用于实体肿瘤细胞的三维培养。

【技术特征摘要】
1.一种细胞三维培养基质，其特征在于，可用于实体肿瘤细胞的三维培养。2.一种细胞三维培养基质，其特征在于，可用于进行抗肿瘤药物筛选。3.一种细胞三维培养基质，其特征在于：采用matrigel，透明质酸钠和中等粘度的藻朊酸钠等天然高分子材料为原料的一种细胞三维培养基质。4.一种细胞三维培养基质，其特征在于：采用matrigel，透明质酸钠和中等粘度藻朊酸钠为原料的一种细胞三维培养基质，matrigel的含量为5％-30％(v/v)，透明质酸钠的终浓度为2-10mg/ml，中等粘度的藻朊酸钠的终浓度为0.1％-2.0％(w/v)。5.一种细胞三维培养基质，其特征在于，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜志云，董宇琴，郑希，张秋炎，王华倩，张焜，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44