本发明专利技术属于基因工程和医学检测领域。具体而言，本发明专利技术涉及一种基于GFAP启动子和慢病毒载体的载体系统，利用GFAP启动子作为慢病毒载体中的启动子。本发明专利技术还提供了该载体系统得制备方法和应用。体内和体外检测结果表明，GFAP启动子可以介导荧光素酶在肝星状细胞的表达，说明人的GFAP启动子可以作为慢病毒递送体系特异靶向定位小鼠HSC中荧光素酶的表达，为肝纤维化的基因治疗提供潜在的临床应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学和基因治疗领域，涉及一种基于GFAP启动子和慢病毒载体的肝星状细胞特异性基因转导方法及其应用。
技术介绍
肝纤维化是大多数慢性肝病的共同特征，主要表现是细胞外基质的大量积累，而肝星状细胞是参与该过程的主要细胞【1】。肝星状细胞主要分布在肝窦间隙内，紧贴肝窦内皮细胞，占肝中细胞总量的5％-10％。在正常肝中，肝星状细胞处在静息状态，并且富含脂滴、维生素A和视黄醇等，当受到病毒、毒素、酒精等导致肝纤维化发生的肝损伤时，静息的肝星状细胞就会转化成类成纤维细胞，在此过程中，肝星状细胞发生形态以及功能改变，比如增殖、收缩性、趋药性、胶原和细胞因子的增加等等【2】，过多的胶原的沉积导致细胞外基质大量的积累以及肝纤维化。肝星状细胞的活化是肝纤维化发生过程中的主要过程，因此肝星状细胞是抗纤维化治疗的重要的靶细胞，主要的治疗手段包括肝星状细胞活化的抑制，活化的肝星状细胞的消除，细胞外基质的降解以及细胞因子的治疗等等【3-4】。已有研究表明对促肝纤维化的细胞因子TGFβ、PDGF和TNF-α的靶向肝星状细胞的敲除可以作为肝纤维化基因治疗的方法【5-7】。比如，通过天然抑制剂【7】、抗体【8】和RNA干扰【9】等方法降低TGFβ的表达或者抑制该信号通路的活性，可以降低胶原的表达和细胞外基质的沉积。在肝纤维化的肝星状细胞靶向的基因治疗中，细胞特异性和高效性的递送系统是非常关键的，一些抗纤维化的药剂则不能通过细胞特异的靶向定位肝星状细胞。因此，肝星状细胞特异的启动子启动肝星状细胞特异的基因可以攻克难关。胶质纤维酸性蛋白GFAP是一种中间纤维，在中枢神经系统的星形胶质细胞中特异性高表达【10】。已有研究表明人的GFAP promoter可以介导转基因小鼠中枢神经系统星形胶质细胞特异的lacZ报告基因的表达【11】。与肝中其他肝细胞相比，GFAP在肝星状细胞中也是特异性高表达的【12-13】。在用更昔洛韦处理由鼠的GFAP promoter启动的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的基因小鼠时，可以使活化的肝星状细胞特异性缺失【14】。另外，由GFAP promoter介导的可以产生转录本(pri-miRNA)的质粒敲减肝星状细胞中TGF-β的表达可以显著降低TGF-β1和胶原在蛋
白和RNA水平的表达【6】。而且，由GFAP promoter启动的表达PDGFR-β shRNA的质粒通过流体动力学(HBT)的转染方式可以特异性敲减四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤中PDGFR-β基因的表达【5】。因此，高效、特异、稳定的递送系统成为本领域的研究热点之一。与本专利技术有关的参考文献：1.Puche JE,Saiman Y,Friedman SL.Hepatic stellate cells and liver fibrosis.Compr Physiol.2013.3(4):1473-14922.Senoo H,Yoshikawa K,Morii M,Miura M,Imai K et al.Hepatic stellate cell(vitamin A-storing cell)and its relative--past,present and future.Cell Biol Int.2010.34(12):1247-12723.Hellemans K,Michalik L,Dittie A,Knorr A,Rombouts K et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-beta signaling contributes to enhanced proliferation of hepatic stellate cells.Gastroenterology.2003.124(1):184-201.4.Friedman SL,Sheppard D,Duffield JS,Violette S.Therapy for fibrotic diseases:nearing the starting line.Sci Transl Med.2013.5(167):167sr161.5.Chen SW,Chen YX,Zhang XR,Qian H,Chen WZ et al.Targeted inhibition of platelet-derived growth factor receptor-beta subunit in hepatic stellate cells ameliorates hepatic fibrosis in rats.Gene Ther.2008.15(21):1424-1435.6.Yang N,Mahato RI.GFAP promoter-driven RNA interference on TGF-beta1 to treat liver fibrosis.Pharm Res.2011.28(4):752-761.7.Baghy K,Iozzo RV,Kovalszky I.Decorin-TGFbeta axis in hepatic fibrosis and cirrhosis.J Histochem Cytochem.2012.60(4):262-268.8.Zhang DW,Zhao YX,Wei D,Li YL,Zhang Y et al.HAb18G/CD147promotes activation of hepatic stellate cells and is a target for antibody therapy of liver fibrosis.J Hepatol.2012.57(6):1283-1291.9.Ogawa T,Iizuka M,Sekiya Y,Yoshizato K,Ikeda K et al.Suppression of type I collagen production by microRNA-29b in cultured human stellate cells.Biochem Biophys Res Commun.2010.391(1):316-321.10.Bignami A,Dahl D.The astroglial response to stabbing.Immunofluorescence studies with antibodies to astrocyte-specific protein(GFA)in mammalian and submammalian vertebrates.Neuropathology and Applied Neurobiology.1976.2(2):
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【技术保护点】
一种基于GFAP启动子和慢病毒载体的载体系统，其特征在于，利用GFAP启动子作为慢病毒载体中的启动子。
【技术特征摘要】
1.一种基于GFAP启动子和慢病毒载体的载体系统，其特征在于，利用GFAP启动子作为慢病毒载体中的启动子。2.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于，扩增GFAP启动子的引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。3.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于，所述GFAP启动子的是人GFAP启动子或者小鼠GFAP启动子。4.如权利要求1所述的载体系统的制备方法，其特征在于，利用GFAP启动子作为慢病毒载体中的启动子。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)扩增并获得GFAP启动子的DNA片段；(2)将...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪海健，赵园园，姜燕，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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