一种细菌活菌数快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种新的细菌活菌数快速检测方法。本方法首先利用安全无毒的亚甲蓝染色液对细菌进行染色，通过涂片、镜检，区分死菌和活菌，计算出细菌的存活率；再利用彼得罗夫〃霍泽细菌计数板对包括死菌和活菌在内的细菌总数进行计数；最后根据所得数据，计算出活菌数。本发明专利技术适用于对单一菌株或从形态上易区分的多个菌株的发酵液、固体菌剂或液体菌剂的活菌数进行有效快速的检测。作为一种优选方案，本发明专利技术在实际应用时，在显微镜上安装CCD，在电脑上安装相应软件，实现直接在电脑屏幕上清晰观测计数，极大地减少了直接在显微镜下多次计数造成的视觉疲劳。本发明专利技术操作简单，安全可靠，成本低廉，准确度高，重复性好，能满足实验室和工业化生产应用的实际需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，涉及一种细菌活菌数快速检测方法。
技术介绍
细菌活菌数的检测，在细菌发酵实验及其工业化生产中的实际发生频率非常高。快速、准确地反映发酵过程中和发酵结束后的发酵液，及其形成菌剂产品后的细菌活菌数，对于实验及其工业化生产具有重要意义。目前常用的微生物活菌数检测方法主要是血球计数板法和稀释平板涂布法。这两个方法虽然操作简单，但是在实际应用中都存在一定问题。血球计数板法比较厚，一般适用于酵母菌(大小一般为1-5μm×5-30μm)等体积较大的微生物，而对于体积较小的细菌(大小一般为0.5-1μm×1-2μm)则不适用。稀释平板涂布法在多次稀释和涂布的过程中，容易造成实测值比实际值偏低及人为操作误差一般较大的问题，而且整个培养时间较长，一般需要过夜、2-3天甚至更长时间，无法做到实时检测，对发酵生产的数据信息反馈存在较为严重的滞后现象，不利于及时发现、处理并解决大规模发酵生产过程中出现的异常情况。CN101413872A公开了一种微生物活菌数快速检测方法，具体公开了以下步骤：a)样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；b)采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；c)微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片
上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。该方法采用离心手段处理发酵液或菌剂复溶后的菌液，因为即使低速离心，也容易去除少量细菌，导致误差增大，数据失真。该方法采用先涂片、固定，后染色，再冲洗的步骤顺序，因为此时的固定如果是用火焰固定的话，则细菌全部死亡，染色结果全是蓝色，无法区分并计算活菌数。如果是风干的话，细菌在载玻片上的贴壁不够牢固，在染色结束后的冲洗过程中，容易造成损失，尤其是在涂片的正面冲洗，损失更为严重。即使在涂片的背面依靠水的牵拉进行柔和的冲洗，也会造成一定程度的损失。另一方面，由于细菌贴壁不牢固，在载玻片上滴加香柏油进行油镜观察时，容易发生细菌被香柏油的自由扩散而挤兑移动的现象，造成无法观察计数。该方法直接在载玻片进行观测计数的方法，因为这样做会因视野的面积不宜精确计算，视野中的细菌太多太乱，及由于涂片不均匀导致的不同视野中的细菌数差异较大，而容易造成计数结果误差较大的问题。因此，开发一种新的、快速高效的细菌活菌数检测方法，对于解决当前发酵生产行业中的数据反馈滞后问题，进一步提高生产效率，具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对目前常用微生物计数方法存在的细菌计数适用性差和计数结果反馈滞后的问题，提供一种新的细菌活菌数快速检测方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种细菌活菌数快速检测方法，包括如下步骤：1)将待测的菌液或者菌剂进行稀释；2)配制亚甲蓝染色液；3)将稀释后的菌液与染色液进行混合，染色；4)将染色后的菌液涂布到载玻片上，吹干后，火焰固定；5)将制好的载玻片放于显微镜下，观察10个以上的视野，视野中染成蓝色的细菌，即为死菌，未被染成蓝色的细菌，即为活菌；计算出细菌存活率；6)用细菌计数板计数细菌总数。在本专利技术一个优选的技术方案中，在计数细菌总数时，在显微镜上安装CCD，在电脑上安装相应软件，实现在电脑屏幕上清晰观测计数。其中，所述亚甲蓝染色液为亚甲蓝0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml；或者，0.025g亚甲蓝、0.042g氯化钾、0.048g六水氯化钙、0.02g碳酸氢钠、1.0g葡萄糖，加0.85％无菌生理盐水溶解，并定容至100ml。其中，所述的细菌为饲用益生菌，包括但不限于乳酸菌、芽孢杆菌等。本专利技术是一套集“亚甲蓝染色、显微镜镜检、计算机成像”于一体的快速检测方法。适用于对单一菌株或从形态上易区分的多个菌株的发酵液、固体菌剂或液体菌剂的活菌数进行有效快速的检测。与CN101413872A相比，本专利技术直接使用发酵液或菌剂复溶后的菌液进行观测，依靠细菌的形态大小及其在液体中极小范围的自由运动，即可跟液体中的固体颗粒物进行明显的区分。本专利技术采用先染色，后涂片、风干及火焰固定的步骤顺序，免去了用水冲洗的环节，避免了冲洗造成的损失。因为细菌在液体中被染色时，死菌即被染成蓝色，活菌不被染色而仍呈无色。经涂片、风干以后，蓝色的死菌和无色的活菌均已贴在载玻片上，而此时的亚甲蓝染色液也已风干而不再具有对死菌的染色能力。此时再用火焰对细菌进行固定，虽然固定完成后细菌全部死亡，但固定前的活菌仍然呈无色
状态，仍然可以跟固定前呈蓝色状态的死菌进行明显的区分。而且火焰固定非常牢固，不会发生细菌被香柏油的自由扩散而挤兑移动的现象。本专利技术采用专门针对细菌大小的细菌计数板进行观测计数，细菌计数板上每个小方格的面积是固定且容易被计数出来的，从而极大地减少了计数结果的误差。本专利技术显微镜上安装CCD，在电脑上安装相应软件，实现在电脑屏幕上清晰观测计数，极大地减少了直接在显微镜下多次计数造成的眼睛疲劳。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。以下实施例所用的显微镜为奥林巴斯显微镜CX31，目镜10×，接物镜100×。彼得罗夫〃霍泽细菌计数板每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.02mm。所以，每个小方格的体积为1/20000mm3。选取细菌计数板计数区的左上、左下、右上、右下四个4×4的方格，以及中间4个4×4的方格，共8个4×4即128个方格，进行计数。实施例1枯草芽孢杆菌发酵液的活菌数检测(1)菌液的稀释：将发酵菌液用无菌水稀释100倍。(2)染色液的稀释：将亚甲蓝染液(亚甲蓝0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml)，用无菌水稀释100倍。(3)彼得罗夫〃霍泽细菌计数板、载玻片和盖玻片的清洗：将细菌计数板、载玻片和盖玻片在75％酒精中浸泡3-5min，取出后用无菌滤纸吸取多余的酒精，吹干，备用。(4)染色：取100μl稀释菌液和100μl稀释染色液，混合均匀。室温静置1min。(5)涂片：接种环经火焰灭菌后，蘸取少量已染色的样品，均匀地涂在普通载玻片上，吹干后，火焰固定。(6)观测：将制好的载玻片放于显微镜下，使用油镜观察10个以上的视野。视野中染成蓝色的细菌，即为死菌。未被染成蓝色的细菌，即为活菌。(7)计算细菌存活率：计数这些视野中的死菌数量和总菌数量，计算出细菌的存活率。(8)用细菌计数板计数细菌总数：将细菌计数板放在显微镜载物台上，取10ul染完色的菌液至细菌计数板的计数区，小心盖上盖玻片，中间不能有气泡。静置1min，使用油镜观察。(9)计数方法：选取左上、左下、右上、右下四个4×4的方格，以及中间4个4×4的方格，共8个4×4即128个方格进行计数。根据所得数据，计算出样品中活菌数的含量。重复计数三次，枯草芽孢杆菌发酵液活菌数的平均值为4.0×109个/ml，误差在10％以内。同时，该样品的三次稀释平板涂布法所得的计数平均值为2.7×109个/ml，误差在10％以内。两者差异不大。实施例2枯草芽孢杆菌菌粉的活菌数检测(1)菌粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌活菌数快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将待测的菌液或者菌剂进行稀释；2)配制亚甲蓝细菌染色液：3)将稀释后的菌液与染色液进行混合，染色；4)将染色后的菌液涂布到载玻片上，吹干后，火焰固定；5)将制好的载玻片放于显微镜下，观察10个以上的视野，视野中染成蓝色的细菌，即为死菌，未被染成蓝色的细菌，即为活菌；计算出细菌存活率；6)用细菌计数板计数细菌总数。

【技术特征摘要】
1.一种细菌活菌数快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将待测的菌液或者菌剂进行稀释；2)配制亚甲蓝细菌染色液：3)将稀释后的菌液与染色液进行混合，染色；4)将染色后的菌液涂布到载玻片上，吹干后，火焰固定；5)将制好的载玻片放于显微镜下，观察10个以上的视野，视野中染成蓝色的细菌，即为死菌，未被染成蓝色的细菌，即为活菌；计算出细菌存活率；6)用细菌计数板计数细菌总数。2.如权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，在计数细菌总数时，在显微镜上安装CCD，在电脑上安装相应软件，实...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兴华，孙晓杰，张乐，刘滢，王安如，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，江西高安大北农饲料有限公司，沈阳英大科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11