单分子电子多重SNP试验以及PCR分析制造技术

本发明专利技术提供使用标记引物或探针用于核酸目标检测和使用纳米孔检测以单分子灵敏度检测核酸序列中的某些位置处的核苷酸的身份或存在的方法；以及供这类方法中使用的寡核苷酸引物组；以及与纳米孔检测结合的定量PCR方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请主张2014年2月12日申请的美国临时申请第61/939,144号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。本申请以引用的方式并入有核苷酸及/或氨基酸序列，所述序列存在于被命名为“150212_0575_86100-PCT_SequenceListing_JAK.txt”的文件中，所述文件的大小是1.81千字节并且在与MS-Windows具有操作系统相容性的IBM-PC机格式下创建于2015年2月12日，包含在2015年2月12日申请的文本文件中作为本申请的一部分。在整个本申请中，引用各种公开。这些参考文献的完整引用在紧接在权利要求书前的说明书的结尾处可见。这些公开的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请中以更充分描述本专利技术所涉及的现有技术水平。
技术介绍
单核苷酸多态性(SNP)是活生物体的基因组中单碱基的变异。SNP可能发生在基因的编码序列和基因的非编码区(包含调节区)中。基因组编码序列中的SNP分类为两种类型：同义和非同义。同义SNP由于遗传密码的简并而不改变蛋白质序列，而非同义SNP改变经编码蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP进一步分为两种类型：错义和无义。错义突变是单核苷酸点突变，产生相比于野生型对不同氨基酸编码的密码子，而无义突变是产生过早终止密码子的点突变。不在蛋白质编码区中的SNP可以通过改变剪接序列和转录因子结合活性以及基因表达来影响基因的功能。在所有遗传变异中，SNP是人与人之间最常见的遗传差异。超过310万个SNP的特征在于第二代人类单倍型图中的人类基因组(弗雷泽(Frazer)等人2007)。因此，SNP是用于研究疾病发展机制下的分子基础，为精密医学奠定基础的重要生物标记物。人类基因组计划和全面的人类基因组序列图的构建(兰德(Lander)等人2001；文特尔(Venter)等人2001；以及惠勒(Wheeler)等人2008)为遗传变异的研究提供有价值的资源。这些遗传差异包含SNP、基因拷贝数变异、插入以及缺失。SNP已被确立为用于疾病基因探索和表征的独特生物标记物(郭(Kwok)2000和罗塞斯(Roses)2000)。这些研究工作需要使用有成本效益并且高通量与高精确度的技术表征大量SNP。以下DNA测序平台广泛用于表征遗传变异：(1)4色荧光桑格法(4-color fluorescent Sanger method)(史密斯(Smith)等人1986；居(Ju)等人1995；居等人1996；萨拉斯-索拉诺(Salas-Solano)等人1998；以及赫特帕尔(Kheterpal)等人1996)；(2)使用可裂解荧光核苷酸可逆终止子的合成测序(SBS)(居等人2006和本特利(Bentley)等人2008)；(3)通过检测由在聚合酶反应期间所释放的焦磷酸引起的化学发光信号进行SBS(焦磷酸测序)(马古利斯(Margulies)等人2005)；(4)通过电子检测在聚合酶反应期间所释放的质子进行SBS(离子激流测序)(罗斯伯格(Rothberg)等人2011)；以及(5)单分子荧光SBS法(哈里斯(Harris)等人2008和艾德(Eid)等人2009)。然而，这些测序技术并非设计用于SNP精确检测，并且对于进行大规模SNP研究来说仍然太昂贵。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和荧光发射是用于SNP分析的两种主要检测方法。使用上述两种检测方法的SNP试验方法如下综述。通过MALDI-TOF MS检测进行SNP分析MALDI-TOF MS测量目标分子的质量，具有高度精确结果呈数字格式。其已通过单碱基延伸(SBE)(哈夫(Haff)等人1997；唐(Tang)等人1999；罗斯(Ross)等人1998；裴(Pei)等人1998；以及格里芬(Griffin)等人2000)、杂交(斯特科(Stoerker)等人2000和罗斯等人1997)以及侵袭性裂解(格里芬等人1999和莱米车夫(Lyamichev)等人1999)用于SNP检测。MALDI-TOF MS还通过聚合酶用于在核苷酸延伸的情况下的基因表达分析和单拷贝DNA单倍型分析(丁(Ding)等人,PNAS 100:3059-3064,2003和丁等人,PNAS 100:7449-7453 2003)。大多数多重SNP分析利用由聚合酶催化的SBE反应的特异性。一种广泛使用的SNP表征方法利用SBE和MALDI-TOF MS检测。在这种方法中，基于目标基因的遗传变异来设计并且合成寡核苷酸引物。引物的3'端紧接着DNA模板的SNP位点退火。接着使与SNP位点互补的单一双脱氧核苷酸通过DNA聚合酶掺入引物中。通过从MALDI-TOF MS谱获得的所得引物延伸产物的质量来确定SNP的身份。通过荧光检测进行SNP分析已使用荧光标记和检测，包含微阵列(哈特曼(Hartmann)等人2009)、PCR-RFLP分析(乔杜里(Chowdhury)等人2007)以及塔克曼(TaqMan)实时基因分型(巴伊(Bai)等人2004)开发多种SNP基因分型方法。使用荧光标记和检测有若干优点，包含多种用于标记目标分子的稳固化学偶合方法，若干光物理参数(寿命、发射以及极化)的检测灵敏度高以及多重能力。分子倒置探针(MIP)方法已被开发用于SNP检测(哈登博(Hardenbol)等人2003)。在这种方法中，连续延伸以及基因座特异性DNA探针的连接在目标基因的多态位点产生圆形形状。接着使线性探针选择性降解，而使含有等位基因信息的圆形DNA探针扩增并且使用荧光检测下的微阵列来分析。使用这种方法，哈登博等人(2003)进行每个试验超过1,000个SNP的基因分型。MIP方法具有非常高的多重水平的优点。然而，MIP需要多个酶反应步骤和复杂的探针设计。先前的多重SNP试验主要使用质谱检测或荧光标签以及光学检测。这些前述试验无一者提供单分子检测灵敏度并且都需要大型仪器。无一者使用纳米孔识别对应于相关核苷酸或SNP的分子或聚合物标签，从而识别相关核苷酸或SNP。
技术实现思路
本专利技术提供一种识别DNA中一段连续核苷酸残基内的位置处的相关单核苷酸残基的方法，其包括以下步骤：(a)使DNA与以下各者一起培育(1)至少一个寡核苷酸引物，每个引物包括以可去除方式连接的标记，所述标记(i)对应于特定引物序列及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名，其中引物中的对于在所述引物的3'端处的核苷酸是5'的核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸的3'的核苷酸完全互补，(2)终止核苷酸，以及(3)DNA聚合酶，以便进行引物的单碱基延伸，引物的3'端核苷酸与DNA中的相关单核苷酸残基杂交，在这个引物存在的情况下使用终止核苷酸，从而形成引物的延伸产物，其具有与DNA中的相关核苷酸互补的3'核苷酸；(b)从延伸产物去除标记，如果存在的话；(c)通过纳米孔检测3'端核苷酸与相关单核苷酸残基杂交的引物的标记的签名，从而识别标记和引物，如果存在的话；从而识别相关单核苷酸残基。在本专利技术方法的实施例中，在步骤(a)中，使DNA与多个寡核苷酸引物一起培育，其中所述多个寡核苷酸引物包括至少两个引物，所述两个引物除在两个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种识别DNA中一段连续核苷酸残基内的位置处的相关单核苷酸残基的方法，其包括以下步骤：(a)使所述DNA与以下各者一起培育(1)至少一个寡核苷酸引物，每个引物包括以可去除方式连接的标记，所述标记(i)对应于特定引物序列及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名，其中所述引物中的对于在所述引物的3'端处的核苷酸是5'的核苷酸基本上与所述DNA中紧接着相关单核苷酸的3'的核苷酸完全互补，(2)终止核苷酸，以及(3)DNA聚合酶，以便进行引物的单碱基延伸，引物的3'端核苷酸与所述DNA中的所述相关单核苷酸残基杂交，在这个引物存在的情况下使用所述终止核苷酸，从而形成所述引物的延伸产物，其具有与所述DNA中的所述相关核苷酸互补的3'核苷酸；(b)从所述延伸产物去除所述标记，如果存在的话；(c)通过纳米孔检测3'端核苷酸与所述相关单核苷酸残基杂交的所述引物的所述标记的所述签名，从而识别所述标记和引物，如果存在的话；从而识别所述相关单核苷酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.12 US 61/939,1441.一种识别DNA中一段连续核苷酸残基内的位置处的相关单核苷酸残基的方法，其包括以下步骤：(a)使所述DNA与以下各者一起培育(1)至少一个寡核苷酸引物，每个引物包括以可去除方式连接的标记，所述标记(i)对应于特定引物序列及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名，其中所述引物中的对于在所述引物的3'端处的核苷酸是5'的核苷酸基本上与所述DNA中紧接着相关单核苷酸的3'的核苷酸完全互补，(2)终止核苷酸，以及(3)DNA聚合酶，以便进行引物的单碱基延伸，引物的3'端核苷酸与所述DNA中的所述相关单核苷酸残基杂交，在这个引物存在的情况下使用所述终止核苷酸，从而形成所述引物的延伸产物，其具有与所述DNA中的所述相关核苷酸互补的3'核苷酸；(b)从所述延伸产物去除所述标记，如果存在的话；(c)通过纳米孔检测3'端核苷酸与所述相关单核苷酸残基杂交的所述引物的所述标记的所述签名，从而识别所述标记和引物，如果存在的话；从而识别所述相关单核苷酸残基。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA是单链DNA或是双链DNA。3.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(a)中，使所述DNA与多个寡核苷酸引物一起培育，其中所述多个寡核苷酸引物包括至少两个引物、至少三个引物或至少四个引物，所述引物除在每一个所述引物的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相同核苷酸序列，其中每一个所述引物中的所述相同核苷酸基本上与所述DNA中紧接着所述相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述终止核苷酸是双脱氧核苷酸，其中所述终止核苷酸包括勾状物，其中所述终止核苷酸包括作为生物素部分的钩状物，或其中所述终止核苷酸包括作为苯基硼酸(PBA)部分的钩状物。5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中在去除所述标记之前使所述延伸产物与未延伸引物分离，或其中在去除所述标记之前通过在涂有抗生蛋白链菌素的磁珠上捕获延伸产物使所述延伸产物与所述未延伸引物分离，或其中在去除所述标记之前通过在涂有水杨基氧肟酸(SHA)的磁珠上捕获延伸产物使所述延伸产物与所述未延伸引物分离。6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述标记通过可裂解连接子以可去除方式连接，或通过作为叠氮基连接子的可裂解连接子以可去除方式连接，或通过在步骤(b)中用含膦部分或三-(2-羧乙基)膦(TCEP)裂解的可裂解连接子以可去除方式连接，或通过与所述标记与所述寡核苷酸之间的所述寡核苷酸引物的5'端连接的可裂解连接子以可去除方式连接。7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述标记包括以下中的一者或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述标记是聚乙二醇(PEG)标记，或是彼此各自具有不同长度的PEG标记。9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中所述DNA与多个引物或至少20个不同寡核苷酸引物一起培育，每个引物包括具有可通过纳米孔检测的独特签名的连接标记。10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的方法，其中所述纳米孔是生物制品，是蛋白质，包括α溶血素，是固态纳米孔，或呈固态膜形式。11.根据权利要求1到10中任一权利要求所述的方法，其中所述签名是电子签名，或是电流封锁签名。12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的方法，其中每个引物的对于所述引物的所述3'核苷酸是5'的部分的核苷酸序列与所述DNA的对于所述相关单核苷酸残基是3'的序列至少85％互补，至少90％互补，至少95％互补或100％互补。13.根据权利要求1到12中任一权利要求所述的方法，其中所述引物的所述序列是10-40个核苷酸长，或是18-24个核苷酸长。14.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其中所述相关单核苷酸位于单核苷酸多态性(SNP)位点。15.一种试验，其用于进行根据权利要求1到14中任一权利要求所述的方法。16.一种寡核苷酸引物组，其中每个引物包括以可去除方式连接的标记，所述标记(1)对应于特定引物序列及(2)具有可通过纳米孔检测的独特签名，其中所述组包括至少两个引物、至少三个引物或至少四个引物，所述引物具有(i)相同核苷酸序列，除在每一个所述引物的3'端处具有不同核苷酸以外，及(ii)对应于所述3'端处的所述不同核苷酸的不同标记，其中每一个所述引物中的所述相同核苷酸基本上与DNA链中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。17.一种寡核苷酸引物组，其中每个引物包括以可去除方式连接的标记，所述标记(1)对应于特定引物序列及(2)具有可通过纳米孔检测的独特签名；并且其中每个引物的所述3'核苷酸与DNA链中的相关单核苷酸残基互补，并且所述引物中的其它核苷酸基本上与所述DNA中紧接着所述相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。18.根据权利要求16到17中任一权利要求所述的寡核苷酸引物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：传娟·陶，希尔·库玛尔，民辰·钱，静月·居，
申请(专利权)人：纽约哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国;US