修饰的RSV F蛋白及其使用方法技术

本发明专利技术一般地涉及经修饰或突变的呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白及其制备和使用方法，包括免疫原性组合物如用于治疗和/或预防RSV感染的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
本申请是中国专利技术专利申请(申请日：2009年12月09日；申请号：200980156344.9(国际申请号：PCT/US2009/067269)；专利技术名称：修饰的RSV F蛋白及其使用方法)的分案申请。对相关申请的交叉引用本申请要求2008年12月9日提交的美国临时申请序列号61/121,126，2009年4月14日提交的美国临时专利申请系列号61/169,077和2009年7月10日提交的美国临时申请系列号61/224,787的优先权，其每一个就所有目的均通过全文提述并入本文。
本专利技术一般地涉及修饰或突变的呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白及其制备和使用方法，包括免疫原性组合物如疫苗以供治疗和/或预防RSV感染。专利技术背景呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒属(Pneumovirus)的成员。人RSV(HRSV)是幼儿中严重下呼吸道疾病的最主要原因，并在人中导致相当的发病率和死亡率。RSV还被认为是在免疫妥协的成人和老人中重要的致病原。由于天然感染之后感染宿主对RSV的不完全抗性，RSV可在儿童期和成人期多次感染。该病毒具有由单链反义RNA组成的基因组，其与病毒蛋白紧密相联形成核壳。病毒包膜由质膜来源、含有病毒编码的结构蛋白的脂双层组成。在病毒粒体中包裹病毒聚合酶，其将基因组RNA转录为mRNA。RSV基因组编码三个跨膜结构蛋白：F、G和SH，两个基质蛋白：M和M2，三个核壳蛋白：N、P和L，以及两个非结构蛋白：NS1和NS2。认为HRSV和细胞膜的融合发生于细胞表面，并为感染早期病毒核糖核蛋白转移至细胞质所必需的步骤。该过程是由融合(F)蛋白介导的，其还促进 受感染细胞的膜与邻接细胞的膜融合以形成特征性的合胞体，其不仅为显著的细胞病变效果，而且还是病毒扩散的另外手段。相应地，中和融合活性在宿主免疫中是重要的。事实上，针对F蛋白开发的单克隆抗体已显示中和病毒的感染性并抑制膜融合(Calder等,2000,Virology 271:122-131)。RSV的F蛋白与其他副粘病毒(paramyxovirus)的F糖蛋白分享结构特征，和有限但却显著的氨基酸序列同一性。其作为无活性的574个氨基酸的前体(F0)合成，所述前体在内质网中在天冬酰胺上在翻译的同时发生糖基化，在此处其装配为同寡聚体。在到达细胞表面之前，F0前体由蛋白酶剪切为来自N端的F2和来自C端的F1。F2和F1链仍由一个或多个二硫键共价连接。已发现免疫亲和纯化的全长F蛋白以微团形式聚集(也表现为玫瑰花结(rosette))，类似于对其他全长病毒膜糖蛋白所观察的一般(Wrigley等,1986,in Electron Microscopy of Proteins,Vol 5,p.103-163,Academic Press,London)。在电子显微镜下，玫瑰花结中的分子表现为或者是倒转的圆锥形杆状物(～70％)或棒棒糖形状(～30％)的结构，其较宽的端从玫瑰花结中央向外伸出。该杆状构象状态与融合前(pre-fusion)失活状态的F糖蛋白相关，而棒棒糖构象状态与融合后(post-fusion)、活性状态的F糖蛋白相关。电子显微术可用于区分融合前和融合后(或者命名为融合前的(prefusogenic)和融合的(fusogenic)构象，如Calder等,2000,Virology 271:122-131所说明。融合前构象还可与融合的(融合后)构象通过脂质体相关测定法来区分。此外，可使用特异性识别存在于RSV F蛋白的一种或另一种融合前或融合的形式，但不存在于其他形式的构象表位的抗体(例如单克隆抗体)来区分融合前和融合的构象。此种构象表位可为由于分子表面上抗原决定簇的偏好性暴露所致。或者，构象表位可来自在直链多肽上非连续的氨基酸的并列。之前已显示F前体在两个位点被剪切(位点I，在残基109之后，和位点II，在残基136之后)，两者之前均为由弗林蛋白酶(furin)样蛋白酶识别的基序。位点II邻近融合肽，且F蛋白在两个位点的剪切对于膜融合是必需的。(Gonzalez-Reyes等,2001,PNAS 98(17):9859-9864)。当在两个位点剪切均完成时，认为杆状物从圆锥形状转变为棒棒糖形状。
技术实现思路
如本文中所述，本专利技术已发现，当对RSV F蛋白的结构进行某些修饰时，可实现令人惊讶的高水平融合(F)蛋白的表达。此类修饰还令人意想不到地减少了RSV F蛋白在宿主细胞中的细胞毒性。此外，本专利技术经修饰的F蛋白表现改善的展示融合后“棒棒糖”形态而非融合前“杆状”形态的能力。因此，在一个方面，本专利技术经修饰的F蛋白还可展示与野生型F蛋白相比改善的免疫原性。这些修饰显然适用于疫苗的开发和使用该疫苗以供治疗和/或预防RSV的方法。本专利技术提供了与野生型RSV F蛋白相比表现表达增加，细胞毒性减少和/或免疫原性增强的重组RSV F蛋白。在一个方面，本专利技术提供了与野生型RSV F蛋白相比包含修饰的或突变的氨基酸序列的重组RSV F蛋白。一般而言，这些修饰或突变使所述RSV F蛋白与野生型RSV F蛋白相比增加表达，减少细胞毒性和/或增强免疫原性。在某些示例性实施方案中，所述RSV F蛋白为人RSV F蛋白。所述RSV F蛋白优选与野生型RSV F蛋白(例如示例于SEQ ID NO:2)相比包含修饰的或突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)位置P102的氨基酸处的修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)位置I379的氨基酸处的修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)位置M447的氨基酸处的修饰或突变。在一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于上述位置的氨基酸处的两个或更多个修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于上述位置的氨基酸处的三个修饰或突变。在一个具体实施方案中，本专利技术涉及其中位置102处的脯氨酸由丙氨酸取代的RSV F蛋白。在另一个具体实施方案中，本专利技术涉及其中位置379处的异亮氨酸由缬氨酸取代的RSV F蛋白。还在另一个具体实施方案中，本专利技术涉及其中位置447处的甲硫氨酸由缬氨酸取代的RSV F蛋白。在某些实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸处的两个或更多个修饰或突变。在某些其他的实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸处的三个修饰或突变。在一个示例性实施方案中，所述RSV蛋白具有SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列。在一个实施方案中，进一步优化所述RSV F蛋白的编码序列以增强其在合适宿主细胞中的表达。在一个实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在一个示例性实施方案中，所述昆虫细胞是Sf9细胞。在一个实施方案中，经密码子优化的RSV F基因的编码序列是SEQ ID NO:3。在另一个实施方案中，所述经密码子优化的RSV F蛋白具有SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含由具有SEQ ID NO:7序列的核酸编码的RSV F蛋白。

【技术特征摘要】
2008.12.09 US 61/121,126;2009.04.14 US 61/169,077;1.一种呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含由具有SEQ ID NO:7序列的核酸编码的RSV F蛋白。2.权利要求1的RSV F蛋白，其中所述信号肽被剪切。3.权利要求1或权利要求2的RSV F蛋白，其中所述蛋白是在昆虫宿主细胞中表达具有SEQ ID NO:7序列的核酸后，通过纯化来自所述昆虫宿主细胞的蛋白获得的。4.权利要求1至3中任一项的RSV F蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：P普什科，Y吴，M马萨雷，Y刘，G史密斯，B周，
申请(专利权)人：诺瓦瓦克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US