水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用制造技术

水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用，命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所提供的稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记特异性高；在实际应用中低成本、高通量；能广泛应用于遗传背景不同的群体中以筛选含有稻瘟病抗性基因Pi的水稻种质。利用该分子标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业生物
，具体地涉及稻瘟病
，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，每年因稻瘟病造成的经济损失达数十亿美元(郑钊等，2009)。我国水稻主产区几乎都受到稻瘟病的危害，年发病面积到330-570万公顷，损失稻谷数亿公斤。从粮食安全和水稻遗传育种的角度来看，培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法之一。但由于稻瘟病生理小种致病性变异快，单一抗性品种的抗性会逐渐丧失(殷得所等，2011)；而传统的抗病育种策略存在工作量大，周期长等特点。因此，迫切需要改变传统抗病育种的策略。基于分子标记辅助选择(Marker-associated selection，MAS)技术的抗病分子育种具有对目标性状的选择不受基因表达和环境条件影响、可在植株生长的任何阶段进行、能在分离世代快速准确地鉴定植株基因型、还可以有效克服目标基因与不利基因的连锁累赘等优点，已被用在水稻稻瘟病的抗性育种领域。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中需对亲本的多态性进行检测；另外，与目的基因有一定距离的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了目的基因的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选的情况(Hayashi et al.，2006；Ingvardsen et al.，2008)。然而，基于基因内部序列所开发的基因特异性分子标记可以使上述问题得到有效解决，从而提高抗性基因的利用效率，有助于稻瘟病抗性育种的开展。Pi5是定位于第9染色体上的广谱抗稻瘟病基因(Jeon等，1994)，测序发现Pi5-1和Pi5-2分别有5和6个外显子。Pi5介导的稻瘟病抗性需要同时具有这两个基因，抗性基因Pi5所表现出的稻瘟病广谱抗性使其在稻瘟病抗性育种工作中具有极大的应用价值。但是，Pi5在我国水稻种质资源和品种中的分布情况尚不明了，制约了该抗性基因在育种中的广泛应用。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi5应用到水稻抗性育种工作中，有必要在抗性基因Pi5的基因内部开发出Ρi5特异的InDel分子标记，这种基因特异性分子标记能对目标基因筛选的准确率理论值达100％。
技术实现思路
解决的技术问题：为了能更快、更有效地将稻瘟病抗性基因Pi5应用到抗性育种中，本专利技术提供一种稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记Pi5InDel及其应用。该分子标记Pi5InDel基于基因序列插入缺失的差异(Insertion-deletion，InDel)研究得到，其能提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中的利用效率。技术方案：水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述携带有稻瘟病抗性基因Pi5的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种IRBL5-M。上述分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因中的应用。上述应用包含如下步骤:(1)扩增:利用引物Fl和Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测:分子量大小为93bp的的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi5；若没有检测到分子量大小为93bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi5。用于扩增所述分子标记的引物对，核酸序列如下所示：SEQ ID NO.2：Fl:5’-GTTTCGAGATAGTGCTAA-3’；SEQ ID NO.3：Rl:5’-GAATGACAGTAATAGAAA-3’。一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的试剂盒，含有核酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pi5InDel，以及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的引物对。本专利技术的原理:插入/缺失(insertion-deletion，InDel)标记基于PCR扩增技术，因其稳定性好、多态性高、分型系统简单，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及医学诊断等领域。本专利技术通过多序列比对的方法寻找Pi5基因序列内部出现的InDel，据此位点的上下游设计引物对F1/R1，用其进行常规PCR扩增，携带有Pi5水稻品种的扩增产物分子量大小为93bp，在本专利技术所要求的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，携带Pi5水稻品种的酶切产物分子量为93bp，而不携带Pi5的水稻品种的酶切产物分子量以95bp或无带呈现。有益效果：(1)本专利技术提供的分子标记特异性高：Pi5所在的基因组区域存在着功能与非功能基因非特性片段，利用已有的标记鉴定会有很多假阳性的结果出现。本专利技术提供的分子标记是经过不断地进行序列多态性搜查，并通过实验验证得到的，能明显地将Pi5与存在于该基因组区域内与Pi5高度同源的旁系同源基因区分开来。(2)本专利技术提供的分子标记在实际应用中低成本、高通量：目前，InDel标记检测方式简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行。本专利技术提供的InDel分子标记的扩增产物带型清晰简单，其稳定性和产物分离效果较好；由于扩增产物较短，对DNA质量要求较低，且对样品量要求较少，甚至能扩增高度降解的DNA，特别适用于生产实践中。(3)本专利技术是第一个针对Pi5基因内部序列所开发的Pi5基因特异性InDel标记。本专利技术能用电泳检测的方法成功地将Pi5与定位在该位点上的其它非Pi5基因区分开。到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本专利技术所提供的Pi5特异性分子标记Pi5InDel是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性和准确性优于显性标记。本专利技术可应用于种质资源分析、Pi5转基因鉴定，基因聚合(尤其是序列高度同源的等位基因的聚合)，以及基于MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于Pi5基因内部，因此对Pi5的筛选能力理论值可达100％，这样的筛选能力优于已报道的与Pi5连锁的分子标记。(4)本专利技术提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi5连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。本专利技术适用于任何遗传背景下的种质资源分析、转基因育种、基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。因此，本专利技术所提供的稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。附图说明图1是JJ813标记在12份代表性品种中的扩增情况，其中:泳道M为DNA ladder，泳道2～12的DNA模板依次为抗性品种IRBL5-M(Pi5)、中花16、粤野占、花节糯、天丰B、明恢63、日本晴、9311、桂朝2号、连粳7号、II-32A、广占63s。图2是Pi5基因特异性分子标记Pi5SNP与JJ813的对比验证图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1:稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记及其引物设计与检测(1)Pi5插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位点的分析:从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi5基因组序列(本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，其特征在于命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，其特征在于命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，其特征在于所述的携带有稻瘟病抗性基因Pi5的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种IRBL5-M。3.权利要求1所述的分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包含如下步骤:(1)扩增:利用引物Fl和Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测:分子量大小为93bp的的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立明，罗玉明，纪剑辉，方继朝，刘永锋，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32