人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，可在单个反应中多重扩增Y染色体上30个低突变率STR基因座。本发明专利技术通过设计独特的基因座排布方式及特异性的引物序列，将30个基因座分为5组，采用六色荧光体统标记。本发明专利技术为国内第一个采用六色荧光检测技术的Y‑STR试剂盒，且为市面上检测基因座数量最多的STR试剂盒，而且包含的基因座全部为低突变率Y‑STR基因座，更加适合男性家系排查。该复合扩增系统引物特异性好、温度耐受范围广、检材适应性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及分子遗传学，具体涉及人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat，STR)是目前普遍应用的遗传标记。其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由2～6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，各基因座的扩增条件相近而能够复合扩增，因而具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，与以往RFLP等技术相比，STR复合扩增技术具有极大的优越性。Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座已有220多个，将已发现的Y染色体STR遗传标记与常染色体STR遗传标记相比，大多数Y染色体STR遗传标记具有复杂重复结构，含有两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体遗传多态性。Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。法医上将突变率高于1％的基因座称为快速突变基因座(Rapidly Mutating Y-STR)。快速突变基因座具有较高的相关男性区分能力，而且一般具有较高的多态性，但基因座突变率较高会干扰某些情况的Y-STR家系排查。目前法医上利用Y-STR进行建库，主要功能是家系排查，缩小嫌疑人范围，而非认定嫌疑人。在中国，特别是农村，主要是家族聚居的方式，在Y-STR建库的实际操作过程中，往往只对一个大家族中一个或者几个成员进行采样建库，这样在花费较小的情况下就能利用Y-STR快速缩小侦查范围，然后通过比对常染色体STR，对嫌疑人进行认定。由于Y-STR建库采样的一个或几个人即代表了整个家系的Y-STR信息，这就存在一种不利的情况：嫌疑人属于此家系一员，但与建库对象Y-STR有3个或更多基因座分型不一致，此时容易将嫌疑人所属的真实家系排除。如果建库试剂盒中快速突变基因座较多，那么这种可能性会变得非常高。另一方面，由于Y-STR建库主要目的不是认定嫌疑人，不需要区分相关男性，因而快速突变基因座的优势在这里用处不大。所以，不建议在这种情况下使用快速突变率的基因座。然而，低突变率基因座往往多态性较低，不利于家系之间的区分。因此，需要基因座的数量要多，同时基因座的多态性要高，以保证Y-STR试剂盒具有足够高的整体多态性。目前市场上主流的商品化试剂盒通常采用的是五色荧光检测技术。但随着Y-STR建库市场的扩大，现有的Y-STR试剂盒已无法满足目前市场的需求，市场急需一个的个体识别率更高，检测基因座数更多的Y-STR试剂盒。然而五色荧光技术对检测基因座数存在一定的限制，因此六色荧光检测技术的建立和应用，是STR荧光检测试剂盒的必然趋势。据此，我们在目前已广泛使用的五色荧光检测基础上，选择合适波长的不同种类第六色荧光进行测试，确定其稳定性和在基因分析仪上的可实现性，最终成功建立了国内第一个Y-STR六色荧光检测系统并在AGCU Database Y30中加以应用，使其突破技术瓶颈成为现市场上同时检测基因座数目最多的STR试剂盒，满足了市场对于Y-STR荧光检测试剂盒个体识别率的需求。目前，市面上主流试剂盒有Plus、Y23、Goldeneye Y26、STRtyper27Y、AGCU Database Y24等荧光检测试剂盒(见表1)，基因座数量分别为17个、27个、23个、26个、27个、24个。法医学常用的的基因座数量较少，累积个体识别率较低，已被确认在某些特定的人群中具有非常低的多态性。Plus、STRtyper27Y、Y23、Goldeneye Y26分别含有7个、7个、2个和3个快速突变基因座。表1市面上主流Y-STR荧光检测试剂盒
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，通过六色荧光检测体系检测，获得一种具有高分辨率、低突变率且能够满足Y-STR建库进行家系快速排查的需求，本专利技术提供一种人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。技术方案：人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含30对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS520。优选的，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：DYS392、SEQ ID NO:1～2；DYS389I和DYS389II、SEQ ID NO:3～4；DYS447、SEQ ID NO:5～6；DYS438、SEQ ID NO:7～8；DYS527a和DYS527b、SEQ ID NO:9～10；DYS522、SEQ ID NO:11～12；DYS391、SEQ ID NO:13～14；DYS456、SEQ ID NO:15～16；DYS19、SEQ ID NO:17～18；DYS388、SEQ ID NO:19～20；DYS448、SEQ ID NO:21～22；DYS385a和DYS385b、SEQ ID NO:23～24；DYS481、SEQ ID NO:25～26；DYS437、SEQ ID NO:27～28；DYS390、SEQ ID NO:29～30；DYS460、SEQ ID NO:31～32；DYS533、SEQ ID NO:33～34；DYS458、SEQ ID NO:35～36；DYS393、SEQ ID NO:37～38；Y_GATA_H4、SEQ ID NO:39～40；DYS439、SEQ ID NO:41～42；DYS635、SEQ ID NO:43～44；DYS444、SEQ ID NO:45～46；DYS643、SEQ ID NO:47～48；DYS549、SEQ ID NO:49～50；DYS557、SEQ ID NO:51～52；DYS520、SEQ ID NO:53～54。针对上述30个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物，引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃。扩增产物长度在75-500bp之间，对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形尖锐峰高正常的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。优选的，所述30对STR基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含30对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS520。

【技术特征摘要】
1.人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含30对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS520。2.根据权利要求1所述的人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：DYS392、SEQ ID NO:1～2；DYS389I和DYS389II、SEQ ID NO:3～4；DYS447、SEQ ID NO:5～6；DYS438、SEQ ID NO:7～8；DYS527a和DYS527b、SEQ ID NO:9～10；DYS522、SEQ ID NO:11～12；DYS391、SEQ ID NO:13～14；DYS456、SEQ ID NO:15～16；DYS19、SEQ ID NO:17～18；DYS388、SEQ ID NO:19～20；DYS448、SEQ ID NO:21～22；DYS385a和DYS385b、SEQ ID NO:23～24；DYS481、SEQ ID NO:25～26；DYS437、SEQ ID NO:27～28；DYS390、SEQ ID NO:29～30；DYS460、SEQ ID NO:31～32；DYS533、SEQ ID NO:33～34；DYS458、SEQ ID NO:35～36；DYS393、SEQ ID NO:37～38；Y_GATA_H4、SEQ ID NO:39～40；DYS439、SEQ ID NO:41～42；DYS635、SEQ ID NO:43～44；DYS444、SEQ ID NO:45～46；DYS643、SEQ ID NO:47～48；DYS549、SEQ ID NO:49～50；DYS557、SEQ ID NO:51～52；DYS520、SEQ ID NO:53～54。3.根据权利要求1或2所述的人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的浓度如下：DYS392、0.06μM；DYS389I和DYS389II、0.07μM；DYS447、0.12μM；DYS438、0.07μM；DYS527a和DYS527b、0.11μM；DYS522、0.14μM；DYS391、0.07μM；DYS456、0.06μM；DYS19、0.15μM；DYS388、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑卫国，李科杰，梅兴林，郭育林，
申请(专利权)人：无锡中德美联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32