细胞的核重编程的方法技术

本文描述了用于增强体细胞的核重编程以变成多潜能干细胞的方法。具体地，本文所述的方法包括使用损伤相关分子模式分子(DAMP)。在某些实施方式中，DAMP是铝组合物，如氢氧化铝。已经意外并令人惊讶地发现这类DAMP增强重编程因子的核重编程效率，该重编程因子常用于诱导体细胞变成经诱导的多潜能干细胞。因此，本发明专利技术描述了核重编程的方法以及通过这类方法获得的细胞和使用这类细胞治疗可通过干细胞疗法治疗的疾病的疗法，以及用于这类用途的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。2013年9月20日创建的所述ASCII拷贝命名为0132-0004PR1_SL.txt，大小为39,860字节。
本专利技术涉及干细胞重编程方法。专利技术背景将分化细胞转化成经诱导的多潜能干细胞(iPSC)为再生疗法提供了更易处理的多潜能细胞来源，已经彻底改变了干细胞生物学。从多种正常和疾病细胞来源衍生的iPSC已经能够生成干细胞，用于在细胞疗法和再生医药中的最终使用。Yamanaka及同事的开创性工作揭示了某些转录因子的异位表达可能在体细胞中诱导多潜能。这些经诱导的多潜能干细胞自我更新并且分化成多种细胞类型，使得它们成为疾病和再生医学疗法的有吸引力的选项。它们已经用于对人类疾病成功建模，并且具有用于药物筛选和细胞疗法的巨大潜力。此外，从疾病细胞中生成的iPSC可用作研究疾病机制和潜在疗法的有用工具。然而，关于体细胞重编程为iPSC的背后机制仍有许多有待理解，并且在缺乏机制认知的情况下存在对潜在临床应用的担心。用于重编程为多潜能的最初的因子组包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、和Nanog。Oct3/4和Sox2是在胚胎干细胞(ES)中保持多潜能的转录因子而Klf4和c-Myc是被认为加强iPSC生成效率的转录因子。转录因子c-Myc被认为修饰染色质结构以使得Oct3/4和Sox2更高效地接触重编程所需的基因而Klf4增强了由Oct3/4和Sox2对某些基因的激活。Nanog，与Oct3/4和Sox2类似，是一种在ES细胞中保持多潜能的转录因子，而Lin28是被认为在分化期间影响特异性mRNA的翻译或稳定性的mRNA-结合蛋白质。还已经显示，Oct3/4和Sox2的逆转录病毒表达以及共同给予丙戊酸、染色质稳定剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂足以将成纤维细胞重编程为iPSC。已经显示几种类型的载体在过表达必需基因组合时诱导多潜能。最早的载体依赖于DNA-整合逆转录病毒和用于核重编程的转座子。虽然有效，但是它们本身产生对于由插入诱变或致癌重编程因子的再表达产生的潜在致肿瘤性的担心。虽然已经使用Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子方法来在基因递送之后从宿主基因组中切除外来DNA，但是两种策略都没有消除诱变的风险，因为它们留下了一小段插入的残留外来DNA。作为遗传修饰的替代，已经显示mRNA、附加体DNA质粒、和细胞渗透蛋白(CPP)是有效的重编程因子。然而，由于它们特定的作用机制或由于它们实践的繁琐性，这些非整合因子在功能上通常导致重编程效率低下。因为，基于非整合和/或小分子的iPSC生成或转分化成不同体细胞类型的方法是临床上相关的载体，增加这类方法使用的稳定性、效率和便捷性变得重要。本专利技术解决了这些问题。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种哺乳动物体细胞的核重编程方法，所述方法包括：将哺乳动物体细胞群与(a)有效剂量的损伤相关分子模式(DAMP)分子；和(b)重编程因子的混合物接触，接触时间足以将哺乳动物体细胞重编程为所需的感兴趣细胞类型。在本专利技术的这一方面的一个实施方式中，DAMP是铝组合物。在另一个实施方式中，同时提供铝组合物和非整合重编程因子的混合物。在另一个实施方式中，依次提供铝组合物和非整合重编程因子的混合物。在另一个实施方式中，铝组合物选自下组：氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。在另一个实施方式中，铝组合物是氢氧化铝。在另一个实施方式中，氢氧化铝以约或至少40-80微克/ml的浓度存在。在另一个实施方式中，氢氧化铝的有效剂量至少或约为30-60微克/ml。在另一个实施方式中，铝组合物是磷酸铝。在另一个实施方式中，铝组合物是硫酸铝。在另一个实施方式中，哺乳动物体细胞是人细胞。在另一个实施方式中，重编程因子的混合物包括使用Oct4、Sox2、Lin28、和Nanog，并且细胞重编程为多潜能。在另一个实施方式中，重编程因子的混合物包括使用Oct4、Sox2、c-Myc、和Klf4，并且细胞重编程为多潜能。在另一个实施方式中，体细胞类型是外周血单核细胞(PBMC)、脐带血单核细胞或成纤维细胞。在另一个实施方式中，重编程因子提供为细胞穿透蛋白。在另一个实施方式中，重编程因子提供为编码重编程蛋白的核酸。在另一个实施方式中，所需的感兴趣细胞类型是经诱导的多潜能干(iPS)细胞。本专利技术的另一个方面包括核重编程方法，其中核重编程效率高于如果不使用铝组合物进行的方法。在本专利技术的这一方面的一个实施方式中，就至少一个关键多潜能标记物的表达来看，核重编程效率高约1至约5倍。在另一个实施方式中，就产生的所需的感兴趣细胞类型的量来看，核重编程效率高约1至约5倍。本专利技术的另一个方面涉及通过本专利技术的任意方法产生的经诱导的多潜能干细胞的群。在一个实施方式中，经诱导的多潜能干细胞是人类细胞。本专利技术的另一个方面涉及用于实施本专利技术的方法的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒包含重编程因子和铝组合物。在另一个实施方式中，该试剂盒还包含体细胞。另一个实施方式涉及用于体内给药的治疗性组合物，其包含DAMP组合物如铝组合物，和一个或多个重编程因子、和/或编码其的核酸、和/或小分子，用于治疗性调节细胞和/或组织表型。另一个方面涉及通过向患者给予治疗有效量的本专利技术的治疗组合物来治疗有此需要的患者的方法。附图说明当考虑附图及相应详细描述时，可以更完整地理解本专利技术。附图所示实施方式仅仅是举例说明专利技术，不应考虑为将专利技术限制于所示实施方式。图1显示了使用本文所述的方法获得iPSC的过程图像。图2、3、4和5显示了使用本文所述的方法在缺氧和正常氧压条件下使用不同浓度的氢氧化铝从多种供体中获得iPSC的实验结果。专利技术详述本文描述了用于增强体细胞的核重编程以变成多潜能干细胞的方法。具体地，本文所述的方法包括使用损伤相关分子模式分子(DAMP)。在某些实施方式中，DAMP是铝组合物，如氢氧化铝。已经意外并令人惊讶地发现这类DAMP增强重编程因子的核重编程效率，该重编程因子常用于诱导体细胞变成经诱导的多潜能干细胞。因此，本专利技术描述了核重编程的方法以及通过这类方法获得的细胞和使用这类细胞治疗可通过干细胞疗法治疗的疾病的疗法，以及用于这类用途的试剂盒。应理解本专利技术不限于所述特定方法、方案、细胞系、动物种或属以及试剂，因为这些可能会有变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本专利技术的范围，本专利技术的范围仅受所附权利要求书的限制。词语“一”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一或多于一个”的意思一致。在整篇申请中，术语“约”用于表示包括装置，用于测定数值的方法，或存在于研究对象中的差异造成的包括固有误差的固有变动的值。通常术语表示视情况而定包括大约或少于1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％或20％可变性。在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。如本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强哺乳动物体细胞核重编程的方法，所述方法包括：将哺乳动物体细胞干细胞群与(a)有效剂量的损伤相关分子模式分子(DAMP)；和(b)重编程因子的混合物接触，接触时间足以将所述哺乳动物体细胞重编程为所需的感兴趣细胞类型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.20 US 61/880,5791.一种增强哺乳动物体细胞核重编程的方法，所述方法包括：将哺乳动物体细胞干细胞群与(a)有效剂量的损伤相关分子模式分子(DAMP)；和(b)重编程因子的混合物接触，接触时间足以将所述哺乳动物体细胞重编程为所需的感兴趣细胞类型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DAMP分子是铝组合物。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，依次或同时提供所述铝组合物和重编程因子。4.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述铝组合物选自下组：氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述铝组合物是氢氧化铝。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，氢氧化铝的有效剂量是约或至少40-80微克/ml。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，氢氧化铝的有效剂量是至少或约60微克/ml。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述铝组合物是磷酸铝。9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述铝组合物是硫酸铝。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞是人细胞。11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重编程因子的混合物包括使用编码Oct4、Sox2、Lin28和Nanog的核酸，或其相应细胞穿透肽，并且所述细胞经重编程为多潜能。12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重编程因子的混合物包括使用编码Oct4、Sox2、c-Myc和KLF4的核酸，或其相应细...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·沃尔什，T·费尔纳，
申请(专利权)人：隆萨有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH