一种肌醇加氧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肌醇加氧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过定点突变获得酶活提升的肌醇加氧酶突变体，并将其与醛酸脱氢酶(udh)在酵母中共表达，强化了葡萄糖二酸合成途径。经比较，重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115‑udh‑mioxK59V/R171S产量最高，摇瓶发酵培养时，在YPD‑MI培养基中，生产葡萄糖二酸1.20g/L。本发明专利技术采用代谢工程策略，改造微生物菌株来合成目的产物葡萄糖二酸，为生物法高效生产葡萄糖二酸奠定了一定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肌醇加氧酶突变体及其应用，属于生物工程

技术介绍
葡萄糖二酸(Glucaric acid，Saccharic acid，GA)又名葡萄糖质酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羟基均被氧化成羧酸而形成的糖酸，主要由葡萄糖氧化制得。葡萄糖二酸及其内酯在一些植物及哺乳动物中均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜(如花椰菜、苜蓿芽等)、水果(樱桃、葡萄柚、柑橘等)中含量丰富。葡萄糖二酸作为一种重要的反应中间体，在生产聚合物材料、食品添加剂及医药临床等领域具有重要的应用价值，并曾被美国能源部选为“最具价值的生物炼制产品”之一。目前葡萄糖二酸的制备主要通过化学氧化葡萄糖的方法，硝酸氧化法可以通过控制反应的过程，将葡萄糖氧化成葡萄糖二酸及一些小分子物质，达到反应的目的，但是，因产生大量有毒的气体或液体，对环境造成一定污染，因此该方法使用受到一定限制。2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)氧化法因其反应条件温和、选择性高，但在反应过程中难以控制温度、pH等条件达到最佳，且催化剂十分昂贵。因此，此方法仍需要加以改进。在生物法中，葡萄糖二酸与抗坏血酸是哺乳动物中葡萄糖醛酸代谢途径的终产物，然而，从葡萄糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。随着合成生物学的发展，微生物法发酵生产葡萄糖二酸也逐渐受到研究者的重视。Prather团队通过组合不同来源的途径酶，在大肠杆菌和酿酒酵母中成功构建了葡萄糖二酸合成途径。但葡萄糖二酸产量还有待提升。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种肌醇加氧酶(miox)突变体，所述肌醇加氧酶突变体是(a)或(b)或(c)：(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，第59位的赖氨酸突变为缬氨酸，或将171位的精氨酸突变为丝氨酸，或在将59位的赖氨酸突变为缬氨酸的同时，将171位的精氨酸突变为丝氨酸；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有肌醇加氧酶酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有肌醇加氧酶酶活性的蛋白质。所得到的肌醇加氧酶突变体K59V、R171S、K59V/R171S氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种重组表达所述肌醇加氧酶(miox)突变体的重组酵母，是将编码肌醇加氧酶(miox)突变体与醛酸脱氢酶(udh)的基因通过融合，克隆表达至酵母菌株中，构建重组酵母。所得重组酵母能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖二酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述醛酸脱氢酶基因udh来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。例如Gene ID:1045739所示的醛酸脱氢酶基因udh。所述的醛酸脱氢酶基因udh前有GAP启动子。在本专利技术的一种实施方式中，编码肌醇加氧酶(miox)突变体与醛酸脱氢酶(udh)的基因在酵母中整合表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述酵母为以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichiapastoris)。在本专利技术的一种实施方式中，醛酸脱氢酶基因udh是以GAP启动子启动。在本专利技术的一种实施方式中，将GAP启动子、udh基因及miox突变基因按照顺序融合，并在融合片段上下游分别引入酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒，转化到宿主菌P.pastoris GS115中即得到重组酵母菌。本专利技术的第三个目的是提供一种利用所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。在本专利技术的一种实施方式中，是将重组酵母菌种子液以5％-10％的接种量接种至发酵培养基中，于25℃-30℃，180rpm-220rpm，培养24h-96h。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基的碳源为葡萄糖和/或肌醇。在本专利技术的一种实施方式中，将种子培养液按10％接种量接种到含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养72h。本专利技术的有益效益：本专利技术通过对葡萄糖二酸途径限速酶：肌醇加氧酶的突变，获得酶活提升的肌醇加氧酶，并将其与醛酸脱氢酶融合共表达，使葡萄糖二酸产量有所提升。重组菌P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V、P.pastoris GS115-Udh-MioxR171S、P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V/R171S葡萄糖二酸产量分别为0.98g/L、1.15g/L及1.20g/L，相比于对照菌株(0.85g/L)，分别提升了15.3％、35.3％及41.2％。附图说明图1肌醇加氧酶突变体酶活；control：P.pastoris GS115-Udh-Miox；K59V：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V；R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxR171S；K59V/R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V/R171S。图2采用不同肌醇加氧酶突变体重组毕赤酵母摇瓶发酵产葡萄糖二酸；control：P.pastoris GS115-Udh-Miox；K59V：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V；R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxR171S；K59V/R171S：P.pastoris GS115-Udh-MioxK59V/R171S具体实施方式序列表中为核苷酸序列信息说明：SEQ ID NO.1为肌醇加氧酶原始氨基酸序列；SEQ ID NO.2为肌醇氧化酶突变体K59V；SEQ ID NO.3为肌醇氧化酶突变体R171S；SEQ ID NO.4为肌醇氧化酶突变体K59V/R171S肌醇加氧酶的酶活测定方法：以肌醇作为底物，根据肌醇加氧酶转化肌醇生成葡萄糖醛酸的含量，检测MIOX的催化活性。肌醇加氧酶单位酶活定义：1min内生成1nmol·mg-1醛酸所需要的酶量。具体检测方法如下：配制含有50mmol·L-1Tris-Cl(pH 7.0)，2mmol·L-1L-半胱氨酸，1mmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2和10g·L-1肌醇的底物反应液。在1.5mL EP管内加入900μL反应液，然后加入100μL破壁后上清粗酶液，立即放入30℃恒温金属浴中反应，反应1h后，通过加入100μL的30％三氯乙酸终止反应。以不添加肌醇的反应液作为对照。将上述反应液取1mL加入玻璃比色管内，然后加入2mL苔黑素试剂，混匀后，在沸水中反应15min。当反应物冷却至室温时，在670nm下测量吸光度。根据葡萄糖醛酸标准曲线计算得出葡萄糖醛酸的含量，从而计算MIOX酶活。葡萄糖二酸产量的测定方法：(1)样品的Affi-Gel凝胶处理：取1mL发酵液在12000r·min-1下离心5min。取0.9mL发酵液上清或葡萄糖二酸标准溶液加入2mL EP管内，然后加入0.1mL 1mol·L-1磷酸钾缓冲液及50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌醇加氧酶突变体，其特征在于，所述肌醇加氧酶突变体是(a)或(b)或(c)：(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，第59位的赖氨酸突变为缬氨酸，或将171位的精氨酸突变为丝氨酸，或在将59位的赖氨酸突变为缬氨酸的同时，将171位的精氨酸突变为丝氨酸；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有肌醇加氧酶酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有肌醇加氧酶酶活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种肌醇加氧酶突变体，其特征在于，所述肌醇加氧酶突变体是(a)或(b)或(c)：(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，第59位的赖氨酸突变为缬氨酸，或将171位的精氨酸突变为丝氨酸，或在将59位的赖氨酸突变为缬氨酸的同时，将171位的精氨酸突变为丝氨酸；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有肌醇加氧酶酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有肌醇加氧酶酶活性的蛋白质。2.编码权利要求1所述肌醇加氧酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。4.一种重组表达所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，是将编码肌醇加氧酶突变体与醛酸脱氢酶的基因通过融合，克隆表达至酵母中，构建重组酵母。5.根据权利要求4所述的一种重组表达所述肌醇加氧酶突变体的重组酵母，其特征在于，所述醛酸脱氢酶基因udh来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。6.根据权利要求4所述的一种重组表...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，巩旭，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32