本发明专利技术涉及一种microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。microRNA标志物组，由miR‑638，miR‑451a，miR‑23a‑3p，miR‑214‑3p和miR‑200c‑3p构成。本发明专利技术首次采用新辅助化疗的临床样本进行microarray分析，发明专利技术人通过筛选获得了具有5个miRNA标志物的microRNA标志物组；针对上述5个miRNA标志物的检测结果与已经建立的风险公式进行比较，可以很好地区分化疗效果的好坏，极大提高预测的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用，属于基因检测
技术介绍
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在妇女恶性肿瘤发病中仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要因素，而且有发病率逐渐上升及年轻化的趋势，成为严重威胁女性健康的重要杀手之一。近几年来，乳腺癌的新辅助化疗越来越广泛地应用于临床，但是由于肿瘤的高度异质性，组织学类型、TNM分期均相同的肿瘤对同一治疗方案的疗效并不一致。有效的化疗能够降低肿瘤分期、提高手术切除率、消灭微小转移灶减少远处转移。如果化疗效果不佳，甚至化疗期间肿瘤进展，不仅浪费了财力，也可能会使患者失去最佳治疗机会，造成严重的后果，所以新辅助化疗效果的预测显得尤为重要。使用生物分子标志物指导乳腺癌化疗一直受到人们的关注。已有研究显示MDR1、BCRP、MRP等耐药相关基因过表达的患者容易产生化疗耐药性。但是单一或少数几个指标用于指导肿瘤化疗的偏差较大。近年来，应用基因芯片检测化疗前肿瘤标本来预测肿瘤的化疗效果逐渐受到研究人员的关注。有研究使用基因芯片显示乳腺癌标本中92个基因的表达有助于预测初次化疗的反应(Lancet.2003；362:362-9)。miRNA芯片是低密度芯片，可同时检测一个标本中几百至几千种人类miRNA的表达，尽管其检测量远低于基因芯片(mRNA芯片、cDNA芯片)，但有趣的是，miRNA芯片在预测患者的预后、确定肿瘤分类或来源方面却更准确(参见Lancet Oncol.2010；11:136-46.和JAMA.2008；299:425-36.)。因此结合miRNA芯片所示的表达情况，构建乳腺癌耐药miRNA表达谱，在预测肿瘤化疗反应方面具有重要的临床指导和应用价值。miRNA(micoRNA，微小RNA)是一类广泛存在的小单链RNA，长度为18-25个核苷酸。它由DNA转录产生，不翻译为蛋白质，是一类能够发挥调控作用的非编码基因。miRNA通过与靶基因mRNA的3’-UTR区部分互补而抑制基因表达。某些情况下，miRNA结合形成的dsRNA可触发类似RNA干扰的机制降解mRNA；或者，并不降解靶基因mRNA而是阻断其蛋白质翻译，如此，负向调控靶基因的表达。随着miRNA研究的不断深入，近年来有很多涉及miRNA参与调控肿瘤化疗耐药的相关研究，某些在瘤组织中表达异常的miRNA被证实与化疗耐药或提高药物敏感性相关。例如Zhu等发现miR-27和miR-451能够通过上调乳腺癌细胞中耐药基因MDR-1的表达，从而降低阿霉素对乳腺癌细胞的生长抑制作用。而miR-30c可通过调控YWHAZ增强乳腺癌细胞MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性。目前，虽然miRNA在肿瘤耐药方面已有部分研究，但到目前为止，miRNA表达谱在预测乳腺癌化疗耐药性的应用报道非常少。主要是由于目前对肿瘤耐药方面的原理尚未完全研究清楚，因此在如何筛选主要评价的标志物方面导致困难，且由于乳腺癌化疗前后的肿瘤标本不易于观察评价乳腺癌细胞对化疗的敏感性，导致筛选标志物后对其作用效果难于评价。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种microRNA标志物组及其在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。该microRNA标志物组可用于乳腺癌化疗耐药的预测、检测或筛查；通过实时定量PCR检测乳腺癌标本中标志物组中所涉及的5个miRNA(miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p)的表达状况，用于评判乳腺癌患者的化疗效果。本专利技术技术方案如下：microRNA标志物组，由miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p构成，miR-638的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。上述microRNA标志物组在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。一种评价乳腺癌化疗敏感性的试剂盒，包括：上述microRNA标志物组；以及microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物。上述microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物均可采用本领域常规市售试剂，如microRNA快速提取试剂可采用Bioteke公司销售的货号RP5301的试剂；反转录试剂(包括反应缓冲液，DNA聚合酶，反转录酶复合物，去离子水)可采用TaKaRa公司销售的货号RR066A的试剂；实时定量PCR试剂(包括反应缓冲液，qPCR复合物，去离子水)可采用GeneCopoeia公司销售的货号AOMD-Q020的试剂；人RNU6B miRNA引物可采用GeneCopoeia公司销售的货号HmiRQP9001的试剂。microRNA标志物组中各microRNA标志物的筛选过程：本专利技术通过miRNA microarray(miRNA表达谱芯片，可同时检测2019个miRNA的表达情况)选择耐药组(MP 1级)和敏感组(MP 5级)各10例乳腺癌化疗前原发灶标本进行分析，结果共发现29个miRNA差异表达的miRNA。专利技术人根据经验结合差异倍数及P值，挑选了15个miRNA进一步通过实时定量PCR在190例临床标本中验证。结果发现6个miRNA标志物：miR-23a-3p，miR-23b-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-638和miR-451a在耐药组和敏感组中存在差异表达，且与芯片结果相符；通过进一步研究发现miR-23b-3p在ROC曲线(受试者工作特性曲线)分析中无统计学意义，专利技术人将5个miRNA标志物：miR-23a-3p，miR-200c-3p，miR-214-3p，miR-638和miR-451a通过Logistic回归构建了风险公式。该耐药表达谱公式可以很好地区分化疗效果的好坏，而且风险数值越高的患者其化疗效果越差；而且比传统的检测单一miRNA指标以及随机组合的5个miRNA具有更高的准确性和特异性。有益效果1、本专利技术首次采用新辅助化疗的临床样本进行microarray分析，专利技术人通过筛选获得了具有5个miRNA标志物的microRNA标志物组；针对上述5个miRNA标志物的检测结果与已经建立的风险公式进行比较，可以很好地区分化疗效果的好坏，极大提高预测的准确性；2、本专利技术通过对所述microRNA标志物组研制相对应的检测试剂盒，用于乳腺癌患者化疗耐药效果的预测，提供个性化治疗方案，具有重要的临床意义和很大的开发价值。附图说明图1、采用qRT-PCR方法在初筛(60例)、验证(59例)、独立(71例)和总体(190例)样本中检测了15个miRNA的表达结果柱状图；其中，图1A为23a-3p的表达结果柱状图；图1B为23b-3p的表达结果柱状图；图1C为miR-638的表达结果柱状本文档来自技高网...
【技术保护点】
microRNA标志物组，其特征在于，由miR‑638，miR‑451a，miR‑23a‑3p，miR‑214‑3p和miR‑200c‑3p构成，miR‑638的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，miR‑451a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，miR‑23a‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR‑214‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR‑200c‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.microRNA标志物组，其特征在于，由miR-638，miR-451a，miR-23a-3p，miR-214-3p和miR-200c-3p构成，miR-638的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，miR-451a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，miR-23a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR-200c-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的microRNA标志物组在制备评价乳腺癌化疗敏感性试剂盒中的应用。3.一种评价乳腺癌化疗敏感性的试剂盒，其特征在于，包括：上述microRNA标志物组；以及microR...
【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏，邢爱艳，王亚文，李玉红，陈旭，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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