抗体纯化方法技术

技术编号:14050243 阅读:101 留言:0更新日期:2016-11-24 04:36
本发明专利技术涉及一种纯化目标抗体的方法,所述方法包括:使包含至少一种目标抗体的细胞培养收获物或蛋白质制剂与至少一种具有7至10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物;使所述混合物与尿囊素接触;以及然后分离固体材料以提供包含所述目标抗体的溶液。固体材料可通过过滤、沉降或离心来移除,并且所述脂肪酸可以是葡萄花酸、羊脂酸、天竺葵酸、壬烯酸或羊蜡酸。本发明专利技术还涉及用于促进所述抗体纯化方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本文所公开的实施方案涉及用于纯化蛋白质,包括抗体,例如IgG和IgM抗体的方法。蛋白质的纯化通常从净化步骤开始,在该步骤中移除细胞和碎片,使得剩余上清液可以通过原本会因细胞和碎片的存在而受阻碍的方法进行处理。它们的移除通常涉及物理方法,例如离心和过滤。这个步骤有时涉及使用具有阴离子交换能力的过滤材料,或者直接向含抗体的收获物中添加阴离子交换粒子或可溶性聚合物(Gagnon,P.,Purification Tools for Monoclonal Antibodies,Validated Biosystems,Tucson,1996;Kuczewski,M.等人,Biopharm Int.23(3)(2010)20-25;Kuczewski,M.等人,Biotechnol.J.,6(2011)56-65)。已经描述了用尿囊素、可溶性有机阳离子和混合粒子对物理净化的细胞培养收获物进行二级处理(Gan,H.等人,J.Chromatogr.A,1291(2013)33-40)。这种方法特别降低由死细胞排出的染色质的含量以及与染色质有关的聚集体的水平,但随后需要三个色谱步骤以获得期望的纯度。尿囊素是FDA批准的广泛用于非处方保健品中的抗炎剂。已知显然可以通过氢键合从蛋白质溶液,包括从IgG溶液移除内毒素(Vagenende等人,ACS.Appl.Mater.Interfaces,22(2013)4472-4478;Vagenende等人,J.Chromatogr.A1310(2013)15-20)。已经公开了通过用羊脂酸(辛酸)进行污染物共沉淀而对IgG抗体进行部分纯化(Chantuin,A.等人,Arch.Biochem.Biophys.89(1960)218-220;McKinney,M.等人,J.Immunol.Met.,96(1987)271-278)。脂肪酸结合所有的蛋白质,但往往特别使酸性非IgG污染物沉淀(Gagnon,见上文;Morais,V.等人,Biotechnol.Appl.Biochem.,59(2012)50-54)。已经指出(Gagnon,见上文)应用于细胞培养收获物的机制和方法开发准则,包括基本变量,例如羊脂酸浓度、pH、盐浓度、温度以及对用以从可溶性IgG制剂移除残余羊脂酸的后续色谱步骤的需要。该技术最通常被描述为制备粗样品以通过其它手段进行后续纯化(Gagnon,见上文;Y.Yigsaw等人,2008,Improving upstream feed stock to downstream operations,Recovery of Biologics Conference XIII,Quebec;Arunakumari,A.等人,美国专利申请20120101262A1),但也作为抛光步骤在通过蛋白A亲和色谱捕获抗体之后被应用(Y.Brodsky等人,Biotechnol.Bioeng.109(2012)2589-2598)。
技术实现思路
在一些方面中,本文所公开的实施方案涉及纯化目标蛋白质的方法,所述方法包括:使细胞培养收获物与至少一种具有7至10个碳原子的脂肪酸以及过饱和浓度的尿囊素接触以形成混合物;以及分离固体材料以提供包含所述目标蛋白质的具有降低的污染物负荷的溶液。如果需要,经处理的液体可以在通过其它纯化方法进行处理之前任选地进一步通过具有包含正电荷的内部接触表面的装置。在一些方面中,本文所公开的实施方案涉及用于纯化抗体的方法,所述方法包括:使细胞培养收获物与至少一种具有7至10个碳原子的脂肪酸接触以形成混合物;使所述混合物与尿囊素接触;以及使所述混合物与非离子性或阳离子性表面活性剂接触,然后移除固体材料,之后提供包含所述抗体的溶液。具体实施方式已经发现,彼此化学拮抗的材料的组合具有与单独依赖于任何一种材料的纯化方法相比以较高水平的纯度和较低水平的浊度提供包括抗体在内的目标蛋白质的出人意料的效果。拮抗材料的组合通常会被预期相互抵消个体效果以及导致低劣的蛋白质纯化、低劣的蛋白质回收率或两者。相反,本实施方案提供限定的窗口,在所述窗口内材料协同工作,以实现实质上超过任何单个组分所提供的能力的蛋白质纯度和回收率水平。这些观察特别适用于抗体,例如IgG和IgM抗体。另外,实验结果表明,组合中的每种组分的反应性曲线与其单独使用时的反应性曲线有所不同。这突出了本文所公开的实施方案的效用不能由单个组分的已知性质或应用来预测。待组合的组分特别包括含有7个或8个或9个或10个碳原子的饱和脂肪酸,或者含有6个或7个或8个或9个碳原子以及1个双键的不饱和脂肪酸;以及带有正电荷的可溶性和/或固体材料。它们可进一步包括尿囊素。在本文所公开的方法中,材料被组合在含有目标蛋白质,例如一种抗体的液体制剂中,然后在合适的孵育时间后,移除固体以提供包含所述抗体的溶液。实验数据表明本文所公开的方法中使用的组分之间的相互拮抗的相互作用。在相互拮抗的一个实例中,已经通过实验显示结晶尿囊素结合细胞培养收获物中的超过99%的脂肪酸,这表明其以类似方式作用于所添加脂肪酸的高的可能性。预期这会降低出于使非抗体污染物沉淀的目的而添加至含有抗体的细胞培养收获物中的脂肪酸的有效性。与此相反,本文所公开的方法的这个方面有助于在低于科学文献中报告为最佳的水平的一半的浓度下脂肪酸的有效使用。不受理论的束缚,这可能是因为通过氢键合络合到未溶解尿囊素的脂肪酸保存其天然电荷、疏水性和结合污染物的能力,同时未溶解尿囊素的物理密度增强其通过沉降的移除。在相互拮抗的另一实例中,添加非常低浓度的非离子性表面活性剂令人惊讶地改善移除游离轻链污染物的有效性,而较大量会损害酸性非抗体蛋白的移除,所述非离子性表面活性剂削弱疏水相互作用并且由此预期会干扰脂肪酸实现其效果的能力。在另一个更令人惊讶的实例中,低水平的干扰脂肪酸的电荷和疏水效果两者的阳离子性表面活性剂大致会使组合移除酸性非抗体蛋白的能力加倍,而较高浓度则具有相反的效果。这些实例突出了当将通常拮抗的组分以适当平衡比例组合时,它们产生可以移除污染物的窗口,所述污染物在不存在此类拮抗剂下不会有效地被移除。已经进一步发现,尿囊素的纳入特别增强脂肪酸沉淀移除微粒的能力。不受理论的束缚,据信尿囊素的效果通过氢键合介导,通过氢键合,大分子集聚物,包括超小粒子,包括病毒结合至较大的尿囊素晶体。由于其1.45克/立方厘米的相对高的密度,尿囊素晶体促进缔合材料的快速重力沉降,并增强其通过离心的沉降。尿囊素晶体也改变脂肪酸-污染物沉淀的物理构成,从典型胶质污泥改变为促进液体通过并提高过滤效率的更像蛋糕的稠度。添加至水溶液中的一部分尿囊素溶解,最多为约36mM,并且据信会削弱蛋白质与脂肪酸的相互作用。溶解的尿囊素被理解为在移除固体后保留在含有抗体的溶液中。虽然这些特征是受欢迎的,但它们代表悖论,因为实验数据表明尿囊素结合99.7%的来自细胞培养收获物的脂肪酸。这意味着,尿囊素的比例理想地仔细进行控制。对于给定应用,适当的比例通过简单的实验来确定,通常从1-2%(w/v)开始。还已经发现,本文所公开的方法出人意料地允许用具有7个或9个或10个碳原子的饱和脂肪酸代替羊脂酸。葡萄花酸(庚酸)含有7个本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种纯化抗体的方法,所述方法包括:(a)使包含至少一种抗体的细胞培养收获物或蛋白质制剂与具有7至10个碳原子的至少一种脂肪酸接触以形成混合物;(b)使所述混合物与尿囊素接触;(c)将固体材料与含IgG的液体分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种纯化抗体的方法,所述方法包括:(a)使包含至少一种抗体的细胞培养收获物或蛋白质制剂与具有7至10个碳原子的至少一种脂肪酸接触以形成混合物;(b)使所述混合物与尿囊素接触;(c)将固体材料与含IgG的液体分离。2.根据权利要求1所述的方法,其中尿囊素以选自由以下组成的组的范围的浓度存在:(a)约0.6%至约30%,(b)约1%至约10%,以及(c)约1%至约2%。3.根据权利要求1所述的方法,其中尿囊素在从非零量到至多约0.6%的范围。4.根据权利要求1所述的方法,其中通过沉降、离心或其组合来移除在步骤(a)或(c)后存在的固体材料。5.根据权利要求1所述的方法,其中通过过滤来移除在步骤(a)或(c)后存在的固体材料。6.根据权利要求5所述的方法,其中过滤包括膜过滤或深层过滤。7.根据权利要求6所述的方法,其中所述膜过滤或深层过滤包括经官能化的接触表面。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述细胞培养收获物或蛋白质制剂含有细胞,并且任选地存在于其中进行细胞培养物生产的生物反应器中。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述细胞培养收获物或蛋白质制剂不含细胞。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述蛋白质制剂是天然存在的生物流体。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述至少一种脂肪酸包含CH3(CH2)...

【专利技术属性】
技术研发人员:彼得·斯坦利·加尼翁
申请(专利权)人:新加坡科技研究局
类型:发明
国别省市:新加坡;SG

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