本发明专利技术提供了来自PD‑L1蛋白质的具体的肽和这些肽的衍生电离特性，其特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱或也可称作多反应监测(MRM)质谱的方法直接定量已经在福尔马林中固定的生物样品中的PD‑L1蛋白质。这类生物样品是经化学保藏和固定的，所述生物样品选自使用含有试剂/固定剂的甲醛处理的组织和细胞，包括福尔马林固定的组织/细胞、福尔马林固定/石蜡包埋(FFPE)的组织/细胞、FFPE组织块和来自那些块的细胞，以及经福尔马林固定和或石蜡包埋的组织培养细胞。使用Liquid TissueTM试剂和方案从所述生物样品中制备蛋白质样品并通过在蛋白质样品中定量至少一种或多种所描述的肽来使用SRM/MRM质谱的方法在Liquid TissueTM样品中定量PD‑L1蛋白质。这些肽在其以修饰的或未修饰的形式存在时可被定量。PD‑L1片段肽的修饰的形式的一个示例是肽序列内酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和/或其他氨基酸残基的磷酸化。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】引言人们使用一批杀伤正在生长和分裂的细胞并以多种方式发挥功能的治疗剂来治疗癌症。常见的化疗剂集合已被单独或联合使用了数十年，且该常见的试剂集合已成为临床肿瘤学实践中传统且常规的癌症治疗手段。这类传统的化疗剂通过杀伤所有快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀伤正在生长的正常细胞，因此这些试剂不被视作杀伤癌细胞的“靶向”方法。近年来，已开发出大量仅特异性靶向癌细胞的癌症治疗剂，其中这些治疗剂特异性攻击仅由癌细胞表达而正常细胞不表达的蛋白质。这种方式被视癌症治疗的“靶向”方法。最近，以“靶向”方式杀伤癌细胞的另一种方法是特异性调控免疫系统以增强癌症患者的免疫系统杀伤癌细胞的能力。已知癌细胞的PD-L1表达增加可使这些细胞规避宿主免疫系统。其中癌细胞表达高水平PD-L1的肾细胞癌与增加的肿瘤侵染性和提高4.5倍的死亡风险相关。此外，与在其癌细胞中具有较低PD-L1表达的卵巢癌患者相比，具有较高PD-L1表达的患者的预后显著较差。在这些患者中，PD-L1表达与上皮内CD8+T淋巴细胞计数负相关，表明在癌细胞外侧上表达的PD-L1可抑制CD8+T细胞的抗肿瘤活性。这鼓励开发PD-L1抑制剂以压制癌细胞的细胞表面上PD-L1的存在，其继而产生更强的CD8+T细胞的癌细胞杀伤活性。基于这一最新癌症治疗方法，重要的是了解癌细胞中的PD-L1表达水平以确定使用PD-L1抑制剂治疗特定癌症是否会对给定患者中免疫介导的癌细胞杀伤产生显著影响。提供了用于一种或多种SRM/MRM测定的肽和肽序列，这些SRM/MRM测定可用于定量测定直接处于来自癌症患者的患者来源的生物样品中的PD-L1蛋白质水平，目的是实现改进的癌症疗法的治疗决定。
技术实现思路
提供来源于PD-L1蛋白质的子序列的特异性肽。PD-L1也称作程序性细胞死亡1配体1，分化群274(CD274)蛋白质和B7同源物1(B7-H1)。PD-L1蛋白质由CD274基因编码，并且在本专利技术中称作PD-L1。来源于蛋白质的各种肽的肽序列和碎片/过渡离子可用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)测定中，其也称为多反应监测(MRM)测定，在下文中称作SRM/MRM测定。描述了用于PD-L1蛋白质及该蛋白质的同种型的SRM/MRM分析的肽的用途。可使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种SRM/MRM测定来检测是否存来源于PD-L1蛋白质的切割的一种或多种特异性肽并测量其相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱法测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中PD-L1蛋白质的总量的方法。可从那些蛋白质中得到的肽中的全部或全部的一部分也可在单一SRM/MRM测定中同时分析或可在单个SRM/MRM测定的任何组合中分析。这些肽各自提供通过质谱对生物样品中获得的给定蛋白质制备物中PD-L1蛋白质总量的测量。本文描述的SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织(例如切除的肿瘤或活检样品)的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(Expression Pathology Inc.)(马里兰州罗克维尔)的Liquid试剂和方案方便地进行。对从癌症患者中手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定是在病理学实践中已经接受的常规方法。因此，甲醛/福尔马林固定的石蜡包埋组织是最广泛可用的来自那些患者的组织形式。甲醛/福尔马林固定通常采用称为福尔马林的甲醛水溶液。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％甲醛或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室温下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内这些蛋白质中的任一种或全部的准确且精确的定量水平，以及这些蛋白质的潜在同种型的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且容许医师或其它医疗专业人员确定用于患者或受试者的适当疗法。提供关于在患病组织中或在另一患者/受试者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段、程度或组织学并确定将最有效地阻止癌症细胞生长的治疗剂，从而确定患者或受试者将最可能应答的治疗剂。更具体而言，对来自患者的癌细胞中的PD-L1蛋白质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种肽的检测和/或定量提供了蛋白质信息，其可指示随后应进行哪种或哪几种治疗方案。专利技术详述本专利技术所述的测定定量或测量来自PD-L1蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自PD-L1蛋白质的特定修饰的肽的相对或绝对水平。修饰的示例包括在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。蛋白质及蛋白质同种型的相对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，例如通过比较SRM/MRM特征峰面积(signature peak area)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。单个PD-L1肽的相对水平可在不同样品(例如，对照样品和由患者或受试者的组织制备的样品)中确定。或者，在各种肽具有其自己的特异性SRM/MRM特征峰的情况下，可以比较PD-L1特征肽中的一种或多种的多个SRM/MRM特征峰面积。通过比较峰面积，可以确定一种生物样品中或一种或多种额外或不同的生物样品中PD-L1蛋白质和潜在蛋白质同种型含量的相对水平。以此方式，可通过在相同实验条件下测定多个(例如，二、三、四、五或更多个)生物样品来确定来自PD-L1蛋白质的一种或多种特定肽的相对含量并从而确定PD-L1蛋白质及潜在同种型的相对含量。另外，确定单一样品内来自PD-L1蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。使用这类方法，可确定来自PD-L1蛋白质的特定肽的含量，从而确定相应蛋白质及其潜在同种型中的每一种的含量，所述含量是相对于同一样品内或不同样品中的一种对于另一种而言的。因为单个肽或多种肽的相对定量可相对于样品内或样品之间的另外一种或多种肽的含量来进行，所以可以确定所存在的肽的相对含量(例如，通过确定一种肽相对于另一种肽的峰面积)，而与生物样品中蛋白质的绝对重量：体积或重量：重量的含量无关。因此，来自生物样品的蛋白质制备物中一种或多种PD-L1肽的含量可用来确定在多种样品内及多种样品之间的PD-L1蛋白质的含量。通常将不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据标准化至每种样品的所分析蛋白质的含量(例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测量生物样品中PD‑L1蛋白质水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量来自所述生物样品的蛋白质消化物中一种或多种修饰的和/或未修饰的PD‑L1蛋白质片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的PD‑L1蛋白质的水平；且其中所述含量是相对含量或绝对含量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.06 US 61/924,2181.一种测量生物样品中PD-L1蛋白质水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量来自所述生物样品的蛋白质消化物中一种或多种修饰的和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质的水平；且其中所述含量是相对含量或绝对含量。2.权利要求1所述的方法，其进一步包括在检测和/或定量一种或多种修饰的或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽之前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。3.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化物通过Liquid TissueTM方案制备。4.权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质消化物包含蛋白酶消化物。5.权利要求1所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述PD-L1蛋白质片段肽包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。7.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、疲液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实体组织。8.权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括定量修饰的和/或未修饰的PD-L1蛋白质片段肽。9.权利要求8所述的方法，其中定量所述PD-L1蛋白质片段肽包括比较一种生物样品中如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的包含PD-L1蛋白质的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的一种或多种PD-L1蛋白质片段肽的含量与不同且单独的生物样品中相同PD-L1蛋白质片段肽的含量。10...
【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·B·克里茨曼，托德·哈姆布拉夫，史诺·塞帕洛比尔，廖伟莉，恩克杨·安，
申请(专利权)人：爱科谱迅病理研究公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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