一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂制造技术

本发明专利技术属于免疫细胞体外培养领域，公开了一种免疫细胞用培养基及构成该培养基的添加剂。本发明专利技术所述的培养基将活性多糖和壳寡糖作为必须的添加成分，在不向培养基中添加血清的情况下可以使免疫细胞得到高效增殖，且提高免疫细胞的细胞毒作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫细胞体外培养领域，涉及一种免疫细胞用培养基及构成该培养基的添加剂。
技术介绍
生物治疗是继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式。生物治疗是通过调动宿主天然防卫机制或给予天然产生的靶向性很强的物质来达到临床治疗效果，生物领域中的一个重要方法就是免疫细胞疗法，即将分离的自身免疫细胞在体外通过细胞因子诱导，扩增出大量具有高度细胞毒性的异质细胞群，再回输到体内发挥治疗作用。此类免疫细胞的种类包括了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)等，在众多的免疫细胞中，CIK细胞由于有杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多种耐药细胞同样敏感以及对正常骨髓造血前提细胞毒性更小等优良特点，广泛的应用于临床。CIK细胞治疗肿瘤的疗效主要取决于输注细胞的数量和杀伤活性。CIK细胞中最具细胞毒活性的是CD3+CD56+细胞(NKT细胞)，NKT细胞表面能够同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性又具备NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点，然而NKT细胞在正常的外周血中含量极低，仅为1％左右。根据实验观察，清除一个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞，而1cm3大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。因此，在体外培养中，提高CIK细胞的绝对数量和其中的NKT细胞的比例对提高临床治疗效果至关重要。传统细胞培养基含有异源血清成分，如牛血清。由于不同批次牛血清活性和因子的不一致，细胞培养中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，制品中残留的牛血清易引起接种者对血清的过敏反应，导致产品和实验结果的重现性差。若使用患者自身血清，必须较大量地使用患者的血液，造成患者的负担增大。因此，人们希望在不使用或尽可能减少血清使用量的培养基中使免疫细胞增殖。目前传统的免疫细胞制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，用适合于淋巴细胞的培养液，加入适量的细胞因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的免疫细胞，但最终获得的免疫细胞的增殖倍数和细胞毒性都不够理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述技术问题。为此，本专利技术提供了一种免疫细胞用无血清培养基
及构成该培养基的添加剂。本专利技术所述的培养基在尽可能不向培养基中添加血清的情况下可以使免疫细胞得到迅速增殖。本说明书中，“免疫细胞”是指与免疫应答有关的所有细胞，主要包括T细胞、B细胞、杀伤细胞(K细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、单核巨噬细胞等。其中T细胞和B细胞又称为免疫活性细胞，因这类细胞受抗原刺激而被活化，分裂增殖、发生特异性免疫应答。作为在本专利技术的培养基中培养的免疫细胞，主要是指识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、K淋巴细胞、NK淋巴细胞等。本专利技术的培养基中进一步含有活性多糖和壳寡糖。其中，活性多糖优选香菇多糖、褐藻多糖和海带多糖，进一步优选香菇多糖。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，是自然界中唯一大量存在的碱性氨基酸寡糖。培养基中的活性多糖浓度优选0.5～20mg/L，进一步优选2～10mg/L；壳寡糖浓度优选1～40mg/L，进一步优选5～36mg/L。本专利技术的培养基中进一步含有血清替代物。当本专利技术的培养基为无血清培养基时，可以最好的发挥本专利技术的效果。在本专利技术中，血清替代物优选KSR(一种商业化的带血清培养添加剂)、N2(一种商业化的血清替代添加剂，成分为胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠)和B27(一种用于培养神经细胞的无血清培养添加剂)的至少一种，但不限于这几种。进一步优选N2作为血清替代物。培养基中的血清替代物浓度优选0～20重量％，进一步优选10～15重量％。本专利技术的培养基中进一步含有抗氧化剂。抗氧化剂具有程序性抑制细胞死亡作用。优选维生素C、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和2-巯基乙醇的至少一种，进一步优选2-巯基乙醇。培养基中的抗氧化剂浓度优选0.01～20mg/L，进一步优选0.1～15mg/L。本专利技术的培养基中进一步含有细胞生长因子。通过细胞生长因子对免疫细胞的诱导作用，实现免疫细胞的增殖。细胞生长因子优选转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)。培养基中的细胞生长因子浓度(含有多种时，为其总浓度)优选0.05～100mg/L，进一步优选0.5～10mg/L。本专利技术的培养基中进一步含有缓冲盐。缓冲盐可维持本专利技术的培养基的pH值保持在6.8～7.2之间。缓冲盐优选碳酸氢钠、磷酸盐和HEPEs。进一步优选HEPEs。培养基中的缓冲盐浓度优选0.05～5重量％，进一步优选0.1～3重量％。本专利技术的培养基中进一步含有动物血清白蛋白。已知白蛋白可以增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤，进一步促进培养细胞的增殖。此外，白蛋白在血液中担负着药物的传递等作用。血清白蛋白优选牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和重组人血清白蛋白(rHSA)的至少一种，进一步优选人血清白蛋白(HAS)。培养基中的动物血清白蛋白浓度优选2～20g/L，进一步优选5～15g/L。本专利技术的培养基除用于免疫细胞的增殖或保持的培养外，还可以对免疫细胞进行诱导培养。用于免疫细胞诱导培养时，可以进一步添加分化诱导剂。作为分化诱导剂，可选细胞因子、集落刺激因子、类固醇激素等，可以单独使用也可联合使用。如在本专利技术实例一中，CIK细胞的诱导培养基中加入的分化诱导剂为白介素2(IL-2)、白介素1α(IL-1α)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CD3激发型单抗，其分化诱导剂的添加量与以往相同。本专利技术的培养基除含有上述活性多糖和壳寡糖及血清替代物、进一步优选含有上述抗氧化剂、细胞生长因子、动物血清白蛋白和缓冲盐的一种以上之外，还可以与公知的细胞用培养基同样。因此基本上通过在公知的基础培养基、优选无血清培养基中添加上述两种必须成分、进一步优选一种以上上述优选的成分，可以获得本专利技术的培养基。以往公知的无血清基础培养基有：MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、RPMI 1640培养基、Ham’s F-12培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基等。本专利技术中优选IMDM培养基。本专利技术的培养基中的免疫细胞培养可以按照与以往同样的方法进行，通常在37℃、5％CO2浓度和饱和湿度的环境下进行。本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述培养基中添加活性多糖、壳寡糖和多种生物因子，可以高效扩增免疫细胞，提高了免疫细胞的生长速度和细胞毒性作用。此外，本专利技术的培养基中不含有血清，大大避免了含血清培养基的血清批次间不稳定、有细胞毒性和大量异源蛋白等缺陷，为免疫细胞的临床治疗提供了很好的工具。附图说明图1是表示实施实例一中，不同实验条件下的CIK细胞的增殖倍数变化示意图。图2是表示实施实例一中，不同实验条件下的CD3+CD4+T细胞的表达变化示意图。图3是表示实施实例一中，不同实验条件下的CD3+CD8+T细胞的表达变化示意图。图4是表示实施实例一中，不同实验条件下的CD3+CD56+T细胞的表达变化示意图。图5是表示实施实例一中，不同实验条件下的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤率变化示意图。图6是表示实施实例二中，不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞用培养基，其特征在于，该培养基含有活性多糖和壳寡糖。

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞用培养基，其特征在于，该培养基含有活性多糖和壳寡糖。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该培养基为无血清培养基。3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，该培养基含有血清替代物。4.根据权利要求3所述的无血清培养基，其特征在于，血清替代物包括KSR(一种商业化的带血清培养添加剂)、N2(一种商业化的血清替代添加剂，成分为胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠)和B27(一种用于培养神经细胞的无血清培养添加剂)等代血清培养添加剂，但不限于这几种，其中优选地是N2。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，活性多糖包括香菇多糖、褐藻多糖和海带多糖，但不限于这几种，其中优选香菇多糖。6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，活性多糖在培养基中的浓度为2～10mg/L，壳寡糖在培养基中的浓度为5～36mg/L。7.根据权利要求1-6中任一项所述的培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟红利，张红梅，李晓宇，张淑敏，杨小平，
申请(专利权)人：烟台赛泽生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37