1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术获得了一个编码1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶的新基因Rsdxs。重组1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶蛋白具有较高的酶活性，和很好的应用前景及开发价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其编码基因与应用。
技术介绍
萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的一类化合物，在自然界生命活动中扮演重要的作用，众多萜类化合物如胡萝卜素、青蒿素(Artemisinin)、紫杉醇(Taxol)、人参皂苷(Ginsenoside)等具有重要的工业及医药应用价值。还有一些化合物是重要的工业原料，如多萜化合物橡胶是汽车和飞机工业的重要原料。自然界中萜类化合物大多数只是生物合成中间体，含量很低且分离纯化操作复杂。化学合成法工艺复杂，收率低，成本高，毒性大，大大限制了萜类化合物的应用。随着萜类化合物生物合成途径的阐明，利用微生物代谢工程生产萜类化合物成为廉价而高效的方法。所有萜类化合物都来自于两种5碳前体：异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP和DMAPP通过聚合反应产生不同的萜类化合物。5碳前体的合成有两条途径：甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP)途径。MVA途径主要存在于古生菌、真菌、植物的细胞液或内质网上，MEP途径主要存在于细菌和植物质体中。甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)途径生产异戊二烯的理论转化率为25.2％，2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP)途径生产异戊二烯的理论转化率为30.2％。MEP途径由于其具有更强的生产优势，自发现以来便受到了国内外科学家的广泛关注并取得了显著研究进展。该途径由8步连续反应催化，将底物丙酮酸和3-磷酸-甘油醛转化为异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。第一步反应是由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(Dxs)催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合生成1-脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)。该步骤是萜类物质合成的第一个限速步骤，许多研究表明Dxs的过量表达可以促进IPP&DMAPP及下游各种萜类化合物的积累，是MEP代谢途径中最重要的遗传操作靶位点。因此如何获得性质优良的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶对萜类化合物的生产非常重要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其编码基因。本专利技术所提供的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶，名称为RsDxs，来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白质。本专利技术所提供的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的编码基因，为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由1914个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由637个氨基酸残基组成。含有所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体中启动所述基因转录的启动子为araBAD启动子。将Rsdxs基因克隆到原核表达载体pSB1s上，得到的重组载体核苷酸序列是序列表中序列3。所述重组菌为将所述编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述编码基因是通过所述的重组载体导入宿主菌中的；所述宿主菌为大肠杆菌BW25113或BW25113Δpgi PT5-idi。扩增所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。所述蛋白质、所述编码基因、所述重组载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备萜类化合物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术以类球红细菌总DNA为模板，用PCR扩增获得一个编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的新基因Rsdxs。将Rsdxs基因克隆到原核表达载体pSB1s上，在大肠杆菌中进行1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶蛋白(RsDxs)的高效表达。获得的重组1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶蛋白可以催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。附图说明图1为Rsdxs的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。图2为重组载体pSB1s-Rsdxs的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。图3为基因工程菌pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI表达产
物的SDS-PAGE分析图。图4为基因工程菌pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI的链孢红素产物的特征吸收峰442nm峰值柱状图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry LWanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，CGMCC 1.1737。本专利技术所提供的宿主菌，为对大肠杆菌BW25113进行A1和A2改造得到，得到的宿主菌命名为BW25113Δpgi PT5-idi(简称PI)。所述A1为将所述宿主菌的磷酸葡萄糖异构酶(pgi)基因敲除(参考Huaiwei Liu,Yuanzhang Sun,Kristine Rose M.Ramos,Grace M.Nisola,Kris Nin～oG.Valdehuesa,Won–Keun Lee,Si Jae Park,Wook-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莎莎，韩莉，刘伟丰，江贤章，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11