本发明专利技术涉及蛋白转导肽－对氧磷酶1融合蛋白及其制备方法和用途。具体而言，本发明专利技术涉及蛋白转导肽对氧磷酶1(P11-PON1)融合蛋白的哺乳动物细胞和家蚕表达方法，该融合蛋白具有粘膜吸收进入体内并且可以透过血脑屏障的活性。该融合蛋白对有机磷农药中毒和肿瘤、动脉粥样硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病具有治疗作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对氧磷酶1的融合蛋白，特别涉及蛋白转导肽与对氧磷酶1的融合蛋白以及所述蛋白的制备和应用。技术背景人血清对氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)是由肝脏合成分泌的分子量为45kDa的糖蛋白，含355个氨基酸，主要存在于血液、肾脏、脾脏、脑等组织器官中。PON1是一类钙离子依赖性高密度脂蛋白相关脂酶，可以水解磷酸酯键，对有机磷化合物具有较强的解毒作用。进一步的研究发现其在调节氧化应激、脂质代谢、抗炎中发挥重要作用，并且与肿瘤、动脉粥样硬化、冠心病、2型糖尿病等多种疾病的发生密切相关。PON1是体内的微量蛋白，从血清中提取该蛋白还存在许多问题。为了研究PON1水解有机磷毒剂和在其他疾病中的作用，利用生物工程方法表达PON1非常必要。PON1是糖蛋白，原核表达不能糖基化修饰，影响蛋白活性。真核系统表达蛋白能够糖基化修饰，所以利用哺乳动物细胞和家蚕(是真核生物)，表达蛋白可糖基化修饰，利于活性发挥。家蚕遗传背景清晰，蛋白表达量高，且可食用，有些药用蛋白可不必纯化就能通过口服吸收。但有些蛋白被消化道蛋白酶降解，降低了其疗效，因此开发用于粘膜吸收的此类蛋白类药物非常必要。
技术实现思路
为了提供可粘膜吸收的PON1蛋白，本专利技术提供一种含蛋白转导肽的对氧磷酶1融合蛋白及其制备方法。本专利技术的融合蛋白可用于制备口含片、鼻喷剂、直肠给入等剂型以用于治疗肿瘤、动脉粥样硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病以及用于在体内或体外降解有机磷。研究发现，在一些蛋白质上具有被称为蛋白转导区
(protein transduction domain,PTD)的小片段，又称为细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)能够有效地通过生物膜，进入各种类型的细胞。外源蛋白质、DNA或复合物与PTD连接后，能够进入细胞和通过血脑屏障。因此，PTD在运送蛋白质、DNA或复合物，并进而在治疗病毒感染，特异性杀伤肿瘤细胞及神经退行性疾病等方面有巨大的潜力。人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)反义激活转录(trans-activator transcription，TAT)蛋白PTD(TAT-PTD)是目前PTD的一种来源。TAT中的11个氨基酸(第47-57位氨基酸，P11)是具有蛋白转导功能的肽段，其序列为YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)。TAT-PTD可以将与之相连的多肽和全长蛋白在数分钟内转导进入细胞，而且可以通过血液循环运输至脑组织，从而可跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内。本专利技术人通过将PON1与P11融合获得了可粘膜吸收的融合蛋白。实验证明，本专利技术的融合蛋白可通过粘膜吸收，无创性地穿透粘膜进入体内，进而可用于治疗肿瘤、动脉粥样硬化、冠心病、2型糖尿病等疾病以及用于在体内或体外降解有机磷。具体而言，本专利技术提供了如下的各个方面。本专利技术一方面提供了P11与PON1的融合蛋白。任选地，PON1可为全长蛋白或为其截短的活性形式。更具体而言，本专利技术的融合蛋白可具有如下的序列：YGRKKRRQRRRMAKLIALTLLGMGLALFRNHQSSYQTRLNALREVQPVELPNCNLVKGIETGSEDL/MEILPNGLAFISSGLKYPGIKSFNPNSPGKILLMDLNEEDPTVLELGITGSKFDVSSFNPHGISTFTDEDNAMYLLVVNHPDAKSTVELFKFQEEEKSLLHLKTIRHKLLPNLNDIVAVGPEHFYGTNDHYFLDPYLQ/RSWEMYLGLAWSYVVYYSPSEVRVVAEGFDFANGINISPDGKYVYIAELLAHKIHVYEKHANWTLTPLKSLDFNTLVDNISVDPETGDLWVGCHPNGMKIFFYDSENPPASEVLRIQNILTEEPKVTQVYAENGTVLQGSTVASVYKGKLLIGTVFHKALYCEL(SEQ ID NO：2)。所以，本专利技术一方面提供了一种融合蛋白，其包含选自如
下的序列：a)SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列；或b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。优选地，本专利技术的融合蛋白为：a)SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列；和b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸且保留取代、缺失、插入或添加前活性的由(a)衍生的氨基酸序列。本专利技术所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1个或几个的氨基酸，是指在序列中的任意且1个或几个氨基酸序列中的位置上取代、缺失、插入或添加1个或几个氨基酸残基(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)，并且取代、缺失、插入和添加中的2种或两种以上可同时发生。本专利技术所述的在氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1个或几个的氨基酸可通过使用《Molecular Cloning 3》(分子克隆3)和《Current Protocols in Molecular Biology》(现代分子生物学操作规程)等记载的定点诱变法获得。对于本专利技术所述的取代，优选在下列各组之内进行氨基酸残基的相互取代：1：亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、甘氨酸；2：天冬氨酸、谷氨酸；3：天冬酰胺、谷氨酰胺；4：赖氨酸、精氨酸；5：脯氨酸、羟基脯氨酸；6：丝氨酸、苏氨酸；和7：苯丙氨酸、酪氨酸。对于本文中所述的保守取代、缺失、插入或添加前活性，
可表示在取代、缺失、插入或添加后的蛋白质或氨基酸序列的活性是取代、缺失、插入或添加前的10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％或更高。上述缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸残基的个数，一般优选小的数目。并且此类蛋白质还可以为：蛋白质，其具有与序列号5的氨基酸序列有约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上的同一性的氨基酸序列、且具有SEQ ID NO：2所具有的无创性高穿透性PON1活性。上述同源性的数值一般优选大的数值。本专利技术的融合蛋白除通过基因工程方法(如下述实施例所述)来获得之外，也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造，或通过肽合成仪进行化学合成。本专利技术的另一方面还提供了编码本专利技术的融合蛋白的核苷酸序列。更本文档来自技高网...
【技术保护点】
融合蛋白，其为如下的形式：SEQ ID NO：1的蛋白转导肽+对氧磷酶1。
【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其为如下的形式：SEQ ID NO：1的蛋白转导肽+对氧磷酶1。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中对氧磷酶1是全长的或有活性的截短的形式。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白为SEQ ID NO：2。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白为SEQ ID NO：6。5.根据权利要求1－4中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是通过在家蚕中表达产生的。6.根据权利要求1－4中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含于家蚕中或者家蚕粉中。7.编码权利要求1－6中任一项的融合蛋白的核苷酸。8.根据权利要求7所述的核苷酸，其中所述的核苷酸包含SEQ ID NO：3或4的序列。9.根据权利要求8所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝全，李前，黄春倩，孙曼霁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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