信使RNA的纯化方法技术

本发明专利技术尤其提供了纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从不纯制剂沉淀mRNA；(b)使含经沉淀的mRNA的所述不纯制剂经历涉及膜过滤的纯化过程，使得通过膜捕获经沉淀的mRNA；以及(c)通过重新溶解所述mRNA从所述膜洗脱所述捕获的经沉淀的mRNA，从而得到经纯化的mRNA溶液。在一些实施方案中，适于本发明专利技术的涉及膜过滤的纯化过程是切向流过滤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2014年4月25日提交的美国临时申请第61/984,503号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。背景信使RNA疗法正成为日益重要的治疗各种疾病的方法。信使RNA疗法涉及向需要该疗法的患者施用信使RNA(mRNA)并在患者体内生成由mRNA编码的蛋白质。因此，非常需要大规模生成适于治疗用途的高纯度且安全的mRNA产物。序列表本说明书参考了序列表(于2015年4月24日以命名为“序列表.txt”的.txt文件以电子方式提交)。该.txt文件生成于2015年4月22日，并且大小为11,184字节。序列表的全部内容通过引用并入本文。专利技术概述本专利技术提供了用于有效纯化信使RNA(mRNA)—尤其是适于治疗用途的体外合成的mRNA—的改进的方法。本专利技术部分地基于意外发现沉淀mRNA接着膜过滤这一非常不同寻常的组合的结果是出乎意料成功地大规模生成高质量mRNA。因此，一方面，本专利技术提供了纯化信使RNA(mRNA)的方法，其包括如下步骤：(a)从不纯制剂中沉淀mRNA；(b)使含经沉淀的mRNA的不纯制剂经历涉及膜过滤的纯化过程，使得通过膜捕获经沉淀的mRNA；以及(c)通过重新溶解mRNA从膜洗脱捕获的经沉淀的mRNA，从而得到经纯化的mRNA溶液。在一些实施方案中，适于本专利技术的涉及膜过滤的纯化过程是切向流过滤。在一些实施方案中，适于本专利技术的涉及膜过滤的纯化过程是直接流过滤。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤包括用含选自由以下组成的组的试剂的溶液处理所述不纯制剂：氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸铵及其组合。在一些实施方案中，合适的试剂是硫氰酸胍。在一些实施方案中，适于mRNA经沉淀的溶液包含浓度为以下的硫氰酸胍：约1M或更高、约2M或更高、约3M或更高、约4M或更高、约5M或更高、约6M或更高，约7M或更高、约8M或更高、约9M或更高或约10M或更高。在一些实施方案中，适于mRNA经沉淀的溶液包含浓度为约4M的硫氰酸胍。在一些这样的实施方案中，合适的溶液还包含月桂基肌氨酸钠和/或柠檬酸钠。例如，在某些实施方案中，适于mRNA经沉淀的溶液包含4M硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸钠和25mM柠檬酸钠。在某些实施方案中，适于mRNA经沉淀的溶液包含4M硫氰酸胍和0.5％月桂基肌氨酸钠。在某些实施方案中，适于mRNA经沉淀的溶液包含4M硫氰酸胍和25mM柠檬酸钠。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤还包括用无水乙醇处理不纯制剂的步骤。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤还包括用异丙醇处理不纯制剂的步骤。在一些实施方案中，适于本专利技术的膜由选自由如下的材料组成的组制成：聚醚砜(mPES)(未改性的)、聚醚砜(mPES)中空纤维膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙酸纤维素、硝化纤维素、MCE(混合纤维素酯)、超高MW聚乙烯(UPE)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙及其组合。在一些实施方案中，本专利技术的方法还包括在洗脱之前洗涤捕获的经沉淀的mRNA。在一些实施方案中，洗涤步骤包括使用含胍缓冲液和乙醇的洗液接着约70-80％乙醇(例如，约70％、75％或80％乙醇)进行多个冲洗循环。在一些实施方案中，适于本专利技术的多个冲洗循环为至少5个或多于5个循环(例如，约5至10个循环或约5、6、7、8、9或10个循环)。在一些实施方案中，洗脱步骤包括用无RNA酶的水重新溶解捕获的经沉淀的mRNA。在一些实施方案中，将无RNA酶的水再循环约5至10分钟(例如，约5、6、7、8、9或10分钟)。在一些实施方案中，本专利技术的方法还包括透析经纯化的mRNA溶液的步骤。在一些实施方案中，用100kDa分子量截留(MWCO)膜以1mM柠檬酸钠透析经纯化的mRNA溶液。在各实施方案中，本专利技术可用于从含体外mRNA合成反应混合物的不纯制剂中纯化体外合成的mRNA。在一些实施方案中，所述不纯制剂包含提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，经纯化的mRNA溶液包含少于约5％(例如，少于约4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.1％)的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在某些实施方案中，经纯化的mRNA溶液包含少于约1％(例如，少于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％)的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在某些实施方案中，经纯化的mRNA溶液包含少于约0.5％(例如，少于约0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，经纯化的mRNA溶液包含少于约0.1％的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，经纯化的mRNA溶液基本上不含提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，通过银染、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)和/或毛细管电泳测量提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。在一些实施方案中，提前中断RNA序列包含少于15个碱基(例如，少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个碱基)。在一些实施方案中，提前中断RNA序列包含约8至15、8至14、8至13、8至12、8至11或8至10个碱基。在一些实施方案中，用于体外合成的所述酶试剂包含T7RNA聚合酶、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，以大于1克、5克、10克、15克、20克、25克、30克、35克、40克、45克、50克、75克、100克、150克、200克、250克、300克、350克、400克、450克、500克、550克、600克、650克、700克、750克、800克、850克、900克、950克、1kg、2.5kg、5kg、7.5kg、10kg、25kg、50kg、75kg或100kg/批的规模纯化mRNA。如下文的实施例所示，利用本专利技术的方法可容易地获得10克或更多(25克或更多)的量的含经纯化的mRNA的批次(batch)。在一些实施方案中，在向mRNA加帽和/或尾之前纯化mRNA。在一些实施方案中，在向mRNA加帽和/或尾之后纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽之后纯化mRNA。在一些实施方案中，在向mRNA加帽和/或尾之前和之后纯化mRNA。在一些实施方案中，mRNA的长度为约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb或更长。在一些实施方案中，mRNA包含一个或多个修饰以增强稳定性。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含经修饰的核苷酸和/或经修饰的糖磷酸骨架。在一些实施方案中，mRNA未经修饰。在一些实施方案中，经纯化的mRNA的完整性为约95％或更大(例如，为或高于约96％、97％、98％或99％)。在一些实施方案中，经纯化的mRNA的完整性为约98％或更大。在一些实施方案中，经纯化的mRNA的完整性为99％或更大。在一些实施方案中，本专利技术提供了信使RNA(mRNA)的纯化方法，所述方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，其包括：(a)从不纯制剂沉淀mRNA；和(b)使含经沉淀的mRNA的所述不纯制剂经历涉及膜过滤的纯化过程，使得通过膜捕获所述经沉淀的mRNA；以及(c)通过重新溶解所述mRNA从所述膜洗脱所述捕获的经沉淀的mRNA，从而得到经纯化的mRNA溶液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.25 US 61/984,5031.一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，其包括：(a)从不纯制剂沉淀mRNA；和(b)使含经沉淀的mRNA的所述不纯制剂经历涉及膜过滤的纯化过程，使得通过膜捕获所述经沉淀的mRNA；以及(c)通过重新溶解所述mRNA从所述膜洗脱所述捕获的经沉淀的mRNA，从而得到经纯化的mRNA溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述涉及膜过滤的纯化过程是切向流过滤。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述涉及膜过滤的纯化过程是直接流过滤。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述沉淀mRNA的步骤包括用含选自由以下组成的组的试剂的溶液处理所述不纯制剂：氯化锂、氯化钾、氯化胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸铵及其组合。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述试剂是硫氰酸胍。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述溶液包含4M硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸钠和25mM柠檬酸钠。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述溶液包含4M硫氰酸胍和0.5％十二烷基肌氨酸钠。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述溶液包含4M硫氰酸胍和25mM柠檬酸钠。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述沉淀mRNA的步骤还包括用无水乙醇处理所述不纯制剂的步骤。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述膜选自由以下组成的组：聚醚砜(mPES)(未改性的)、聚醚砜(mPES)中空纤维膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙酸纤维素、硝化纤维素、MCE(混合纤维素酯)、超高MW聚乙烯(UPE)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙及其组合。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在洗脱之前洗涤所述捕获的经沉淀的mRNA。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述洗涤步骤包括使用含胍缓冲液和乙醇的洗液接着约70-80％乙醇进行多个冲洗循环。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个冲洗循环为多于5个循环。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗脱步骤包括用无RNA酶的水重新溶解所述捕获的经沉淀的mRNA。15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述无RNA酶的水再循环5至10分钟。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括透析所述经纯化的mRNA溶液的步骤。17.根据权利要求16所述的方法，其中用100kDa分子量截留(MWCO)膜以1mM柠檬酸钠透析所述经纯化的mRNA溶液。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体外合成所述mRNA，并且所述不纯制剂包含体外mRNA合成反应混合物。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述不纯制剂包含提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述经纯化的mRNA溶液包含少于约1％的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述经纯化的mRNA溶液包含少于0.5％的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述经纯化的mRNA溶液包含少于0.1％的提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。23.根据权利要求19所述的方法，其中所述经纯化的mRNA溶液基本上不含提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。24.根据权利要求23所述的方法，其中通过银染、凝胶电泳、HPLC、UPLC和/或毛细管电泳测量所述提前中断RNA序列和/或用于体外合成的酶试剂。25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述提前中断RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·德罗莎，A·迪亚斯，S·卡夫，M·哈特莱因，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US