一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用技术

本发明专利技术公开了一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用，包括以下步骤：S1：获取植物组织样本并提取样本DNA；S2：采用ITS引物和/或对样本DNA进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序。S3：将3次测序得到的序列通过DNAMAN软件进行比对，剪去两端不一致的不可信序列，得到植物组织样本的ITS序列和trnL‑F序列，用于鉴定该植物组织样本是否为世纬苣苔。本鉴定方法从分子水平分析分析世纬苣苔的遗传物质，进而能够快速准确的鉴定植物世纬苣苔，为世纬苣苔的保护和药用价值研究奠定基础。

Application of nucleotide sequence identification method for the weft dealbatus and nucleotide sequence

The present invention discloses the application of nucleotide sequence identification method for the weft dealbatus and nucleotide sequence, which comprises the following steps: S1: obtaining plant tissue samples and DNA samples were extracted using ITS primers; S2 and / or DNA sample were PCR amplified PCR products electrophoresis after PCR sequencing of PCR amplified products. S3: 3 sequence comparison were obtained by DNAMAN software, to cut ends of inconsistent untrusted sequence, ITS sequence and trnL plant tissue samples of F sequences, for the identification of the plant tissue samples for Shi Wei dealbatus. The identification method for analysis of genetic material analysis of Shi Wei Chirita from molecular level, which can quickly and accurately identify plant Shi Wei dealbatus, laid the foundation for the value of protection and medicinal dealbatus Shi wei.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药用植物种质资源鉴定
，具体涉及一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用。
技术介绍
世纬苣苔Tengia scopulorum Chun，又名黔苣苔，中国贵州特有珍稀濒危药用植物。当年邓世纬先生与助手杨昌汉、徐方才、黄孜文四人为了采集这批植物野外染病，相继殉职，付出了生命的代价。如今原模式产地（贵定平伐）种群疑似已经消亡。就生物多样性而言，濒危物种是优先保护对象。并且世纬苣苔对于苦苣苔科系统分类和进化发育的研究具有非常重要的科学价值与意义，是不可替代的宝贵材料。同时受资源量限制，世纬苣苔的药用研究尚属空白。保护及进一步的科学研究，面临的首要问题都是原植物的鉴定。而传统的植物形态鉴定必须要等到花期，具有较大的时间限制，对操作人员的鉴别能力有较高的要求。同时由于样本量和相关研究较少，现有文献也未公开有用于世纬苣苔的DNA鉴定识别条形码序列。
技术实现思路
针对现有世纬苣苔的物种鉴定存在鉴别时间段限制以及鉴别难度较大的技术问题，本专利技术公开了一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法及核苷酸序列的应用，本鉴定方法从分子水平分析分析世纬苣苔的遗传物质，进而能够快速准确的鉴定植物世纬苣苔，为世纬苣苔的保护和药用价值研究奠定基础。一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：获取植物组织样本并提取样本DNA；S2：采用ITS引物对样本DNA进行PCR扩增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物，电泳检测PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；和/或采用trnL-F引物对样本DNA进行PCR扩增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物，电泳检测分离出PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；S3：将多次测序得到的序列通过DNAMAN软件进行比对，剪去两端不一致的不可信序列，得到植物组织样本的ITS序列和trnL-F序列，将ITS序列与SEQ ID NO.13所示的序列进行比对，将trnL-F序列与SEQ ID NO.14所示的序列进行比对，以鉴定该植物组织样本是否为世纬苣苔。进一步的，在步骤S1中，所述植物组织样本为带有叶绿体的叶片组织样本，并采用硅胶对所述植物组织样本进行干燥。进一步的，步骤S1包括：取0.5-2cm3的硅胶干燥叶片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷冻后用磨碎机碾磨30s，加入800μL65℃预热过的CTAB溶液，再加入0.5%浓度的β-巯基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液为包括体积比为24：1的氯仿和异戊醇，摇匀10min；然后10℃，12000rpm,离心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，离心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，4℃，12000rpm,离心7min；取上清，转至1.5mL的EP管；加入等量-20℃的异丙醇，-20℃下静置1-2h，使DNA沉淀出来；静置后，4℃，12000rpm,离心10min，弃上清；加入300μL 75%乙醇，洗涤两次，每次4℃，12000rpm，离心10min；自然风干30min左右，加60μL的DDH2O溶解DNA30min左右，得到样本DNA；用凝胶电泳检测总DNA。进一步的，步骤S2中，PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq酶 0.1 μL，样本DNA 1 μL，ITS上游引物或trnL-F上游引物 2 μL，ITS下游引物或trnL-F下游引物 2μL；所述dNTP的浓度为2.5 mmol/L，所述ITS上游引物、trnL-F上游引物、ITS下游引物、trnL-F下游引物的浓度均为2 mmol/L。进一步的，步骤S2中，PCR扩增的反应过程包括：94℃预变性4min后进入循环，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，循环32次，72℃延伸10min。进一步的，步骤S3中还包括：将得到的ITS序列和trnL-F序列输入植物遗传序列数据库进行比对，确定近缘物种。如上所述的SEQ ID NO.13序列在世纬苣苔鉴定中的应用。如上所述的SEQ ID NO.14序列在世纬苣苔鉴定中的应用。根据本专利技术提供的世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，是本专利技术人通过不同引物PCR扩增试验后发现，采用ITS引物和trnL-F引物进行PCR扩增后得到的ITS序列和trnL-F序列具有与其他种类植物较大的区别特征，即ITS序列和trnL-F序列与其他物种的遗传序列具有较大的区分度，将其应用于世纬苣苔的物种鉴定，与传统的形态鉴定相比，本DNA序列鉴定方法受植物生长期限制小，鉴定所需的植物组织材料极少，格外适用于珍稀濒危植物的鉴定；另一方面本方法能够降低鉴定鉴定过程的不稳定因素，同时因为序列的量化特征而减少了人为主观的介入，使得世纬苣苔的鉴定过程更加快速准确，为世纬苣苔的保护与研究提供了可靠依据。具体实施方式下面将对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本实施例采用的材料是贵阳中医学院何顺志教授在贵阳市发现并鉴定的一个世纬苣苔居群的随机采样样本，凭证标本存放于中科院植物研究所王印政研究组，标本编号LMT-2012-016。选取居群不同位置点多个植株的新鲜叶片各1片，立即用硅胶干燥封存。取世纬苣苔硅胶干燥的叶片，采用改良后的CTAB法提取总DNA。提取总DNA操作为：取0.5-2cm3的硅胶干燥叶片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷冻后用磨碎机碾磨30s，加入800μL65℃预热过的CTAB溶液（十六烷基三甲基溴化铵溶液），再加入0.5%浓度的β-巯基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液为包括体积比为24：1的氯仿和异戊醇，摇匀10min；然后10℃，12000rpm,离心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，离心；取上清至1.5mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，4℃，12000rpm,离心7min；取上清，转至1.5mL的EP管。加入等量-20℃的异丙醇，-20℃下静置1-2h，使DNA沉淀出来；静置后，4℃，12000rpm,离心10min，弃上清；加入300μL 75%乙醇，洗涤两次，每次4℃，12000rpm，离心10min；自然风干30min左右，加60μL的DDH2O（双蒸水）溶解DNA30min左右，得到样本DNA；用凝胶电泳检测总DNA（取2μL母液，用6× Loading buffer）。采用ITS引物对样本DNA进行PCR扩增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物。PCR扩增的反应体系包括：10×Buffer 2 μL，dNTP（2.5 mM） 1.6 μL，DDH2O 11.3 μL，Taq本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：获取植物组织样本并提取样本DNA；S2：采用ITS引物对样本DNA进行PCR扩增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物，电泳检测PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；和/或采用trnL‑F引物对样本DNA进行PCR扩增，所述trnL‑F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL‑F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL‑F下游引物，电泳检测分离出PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；S3：将多次测序得到的序列通过DNAMAN软件进行比对，剪去两端不一致的不可信序列，得到植物组织样本的ITS序列和trnL‑F序列，将ITS序列与SEQ ID NO.13所示的序列进行比对，将trnL‑F序列与SEQ ID NO.14所示的序列进行比对，以鉴定该植物组织样本是否为世纬苣苔。

【技术特征摘要】
1.一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：获取植物组织样本并提取样本DNA；S2：采用ITS引物对样本DNA进行PCR扩增，所述ITS引物包括SEQ ID NO.1所示的ITS上游引物和SEQ ID NO.2所示的ITS下游引物，电泳检测PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；和/或采用trnL-F引物对样本DNA进行PCR扩增，所述trnL-F引物包括SEQ ID NO.3所示的trnL-F上游引物和SEQ ID NO.4所示的trnL-F下游引物，电泳检测分离出PCR扩增产物后，对PCR扩增产物进行测序；S3：将多次测序得到的序列通过DNAMAN软件进行比对，剪去两端不一致的不可信序列，得到植物组织样本的ITS序列和trnL-F序列，将ITS序列与SEQ ID NO.13所示的序列进行比对，将trnL-F序列与SEQ ID NO.14所示的序列进行比对，以鉴定该植物组织样本是否为世纬苣苔。2.根据权利要求1所述的一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，其特征在于，在步骤S1中，所述植物组织样本为带有叶绿体的叶片组织样本，并采用硅胶对所述植物组织样本进行干燥。3.根据权利要求1或2所述的一种世纬苣苔的核苷酸序列鉴定方法，其特征在于，步骤S1包括：取0.5-2cm3的硅胶干燥叶片置于2mL的EP管中，放入小磁珠，液氮冷冻后用磨碎机碾磨30s，加入800μL65℃预热过的CTAB溶液，再加入0.5%浓度的β-巯基乙醇10μL，65℃水浴2h；加入800μL的CI溶液，所述CI溶液为包括体积比为24：1的氯仿和异戊醇，摇匀10min；然后10℃，12000rpm,离心10min；取上清至2mL的EP管中，加CI溶液，摇匀，离心；取上清至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明涛，何顺志，
申请(专利权)人：刘明涛，
类型：发明
国别省市：贵州;52