一种基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物Aβ寡聚体的探针的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法，该方法是：将阿尔茨海默症标志物适体修饰在纳米金表面，得到探针；将一系列不同浓度的Aβ寡聚体标准液先分别与所述探针反应，再分别与NaCl溶液反应，反应液通过紫外检测纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚体浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线，对待测液进行检测并依据标准曲线进行分析，即得待测液中Aβ寡聚体的浓度；该方法能实现阿尔茨海默症标志物浓度的检测，且具有稳定性好、成本低、快速的优点。

Method for detecting Alzheimer's disease marker by colorimetric method based on aptamer

The invention discloses an aptamer colorimetric method to detect Alzheimer's disease marker based method, the method is: Alzheimer's disease marker aptamer modified by the probe on the surface of gold nanoparticles,; a series of different concentrations of A beta oligomers were standard solution and the probe reaction, then with NaCl solution, reaction solution by ultraviolet UV detection of gold nanoparticles aggregation and dispersion of the absorption peak, the establishment of A beta oligomer concentration standard curve dispersed gold nanoparticles aggregation corresponding ultraviolet UV absorption peak and absorption peak of gold nanoparticles treated liquid ratio, and on the basis of standard curve detection that is to be analyzed, concentration of solution in A beta oligomers; this method can realize the detection of Alzheimer's disease biomarker concentrations, and has the advantages of good stability, low cost, fast.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测阿尔茨海默症标志物的方法，特别涉及一种基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法；属于生物纳米领域。
技术介绍
阿尔茨海默症已经成为二十一世纪威胁人类健康的重大疾病之一，它是一种退行性疾病，特点为逐步认知能力下降，不可逆的有害的障碍以及可观察到的记忆障碍。阿尔茨海默症患者脑内有老年斑沉积，Aβ淀粉样蛋白是老年斑的主要成分，因此可以通过检测Aβ淀粉样蛋白来预估老年痴呆的程度，同时据研究发现，Aβ寡聚体对神经元突触有毒害作用，而且在阿尔茨海默症患者脑脊液中的含量明显比正常人中的含量高。因此专利技术一种能快速检测Aβ寡聚体的含量，且灵敏性高，易于操作，并能特异性识别Aβ寡聚体的方法就显得尤为重要。目前存在的电化学，荧光，SPR检测Aβ的方法，均有其优势也有其劣势，有效性，易于操作，无辐射是共有的优势，但由于Aβ物种通常为Aβ单体，Aβ寡聚体，Aβ聚集体的混合物，如果检测方法不能准确的识别Aβ寡聚体，会使其灵敏性降低，而且对于电化学方法不够具有时效性。同时目前也有通过计算机技术来检测Aβ寡聚体的方法，但是由于缺少分子平台，所以它对于设计一个分子在Aβ物种中检测Aβ寡聚体仍然是一个巨大的挑战。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是在于提供一种操作简单、快速、低成本的通过比色法检测Aβ寡聚体的方法。为了实现上述技术目的，本专利技术提供了一种基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法，该方法包括以下步骤：1)通过柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金；2)将阿尔茨海默症标志物适体修饰在所述纳米金表面，得到探针；3)将一系列不同浓度的Aβ寡聚体标准液先分别与所述探针反应，再分别与NaCl溶液反应，各所得反应液分别通过紫外检测纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚体浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线；4)将含Aβ寡聚体的待测液按3)步骤通过紫外检测并依据标准曲线分析，即得待测液中Aβ寡聚体的浓度。本专利技术的技术方案，主要是基于纳米金处于分散状态时，在522nm处有其独特的吸收峰，而当纳米金聚集时，其吸收峰会红移的特点。纳米金在浓度较高的氯化钠浓度中，会聚集成聚集态，其在696nm处出现吸收峰，从而会发生变色反应(溶液颜色也会随之由酒红色变成蓝色)。而本专利技术的技术方案，将阿尔茨海默症标志物适体修饰在纳米金上构成探针，当阿尔茨海默症标志物存在时，会与纳米金表面修饰的阿尔茨海默症标志物适体结合，形成G-四联体结构，使得纳米金的耐盐性增强，从防止纳米金聚集，因此可以通过紫外测定待测液中纳米金聚集态696nm处吸收峰值与纳米金522nm处吸收峰值的比值，可以实时表征标志物的浓度。优选的方案，纳米金尺寸为13nm～15nm。较优选的方案，所述的纳米金的制备过程为：将浓度为0.005～0.015wt％氯金酸溶液加热至沸腾后，加入浓度为1.5～2.5wt％的柠檬酸钠溶液进行反应，直至反应液变成酒红色后，保持反应液沸腾15～20分钟，冷却至室温，即得纳米金；其中，氯金酸与柠檬酸钠的质量比为1:3～5。优选的方案，将阿尔茨海默症标志物适体与纳米金在室温下反应，得到探针。较优选为：将阿尔茨海默症标志物适体与纳米金按(350～450)nM:2nM的比例，在25℃～40℃温度下反应10～15分钟，得到探针。优选的技术方案中，探针表面的阿尔茨海默症标志物适体修饰量易于调控。可以通过简单调节孵育过程中阿尔茨海默症标志物适体浓度，以及适体与纳米金的反应比例，来实现适体在纳米金表面的结合量，易于使适体在纳米金表面的结合量达到最大化。优选的方案，将浓度为0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、0.75μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM的Aβ寡聚体标准液分别与探针反应30～60min，再分别与170～180mM的NaCl溶液反应5～10min后，分别采用紫外检测Aβ寡聚体标准溶液中纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，并建立Aβ寡聚体浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线。优选的方案，阿尔茨海默症标志物适体为AβOligomer对应的适体。本专利技术的方法采用阿尔茨海默症标志物适体来作用于相应的Aβ寡聚体蛋白，具有更高的特异性和识别力，检测的灵敏度更高。本专利技术方案中采用的阿尔茨海默症标志物适体可以通过现有的常规方法筛选方法获得，或者直接通过购买得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。本专利技术方案中采用的阿尔茨海默症标志物适体无任何修饰，主要通过静电力吸附结合于制备的纳米金表面。相对现有技术，本专利技术技术方案带来的有益技术效果：1)本专利技术的技术方案构建的探针采用的是阿尔茨海默症标志物对应的适体，没有干扰物质，检测限低，具有特异性识别，检测灵敏度更高。2)本专利技术的技术方案探针的制备及用于Aβ寡聚体的检测过程简单、重复性好。探针仅采用一种核酸分子链，且无修饰成分，相对于使用具有巯基，信号分子等修饰的适体而言，成本很低。3)本专利技术的构建的探针为纳米金与适体的复合物，适体直接捕捉目标物，因此可直接用来检测标志物。4)本专利技术的技术方案以阿尔茨海默症标志物适体(aptamer)来作用于阿尔茨海默症标志物，同时根据溶液的紫外曲线来分析阿尔茨海默症标志物的含量，具有灵敏度高、检出限低、特异性强的特点。5)本专利技术技术方案采用的适体序列可变，适体更换序列后可以推广到检测相对应的其他标志物，如多肽，DNA，RNA，使得传感器能得到更广泛的应用，具有一定的普遍性。附图说明【图1】为本专利技术检测阿尔茨海默症标志物的原理示意图；【图2】为制备的纳米金的透射电子显微镜图；【图3】为检测不同浓度标志物的紫外图；【图4】为特定盐浓度下，探针溶液透射电子显微镜图；【图5】为特定盐浓度下，加入了一定浓度AβOligomer后的透射电子显微镜图；【图6】为通过紫外检测Aβ寡聚体标准液建立Aβ寡聚体浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率(A696/A522)的标准曲线。具体实施方式以下实施例旨在进一步说明本
技术实现思路
，而不是限制本专利技术权利要求的保护范围。实施例1(1)纳米金制备，及其纳米金与适体结合制备探针，步骤如下：首先将100mL 0.01％氯金酸在搅拌下，加热至沸腾，然后迅速往沸腾的溶液中加入2mL 2％柠檬酸钠溶液，继续搅拌使之混合均匀，此时搅拌不宜过于剧烈，以免混合不均匀，同时保持继续沸腾状态，当颜色由无色转为酒红色时，开始计时，继续加热15min，然后把溶液从油浴锅中拿出，放置磁力搅拌器上搅拌冷却至室温，然后利用紫外分光光度计以及粒径分析仪进行纳米金溶液粒子尺寸和分散程度的表征。(2)纳米金与适体结合将阿尔茨海默症标志物适体与纳米金在室温下反应10-15分钟，得到探针。阿尔茨海默症标志物适体与纳米金的比例为400nM:2nM。(3)建立标准曲线：分别配制不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.5,0.75,2.5,5,10,20,40μM)的AβOligomer，分别依次加入到以上构建的纳米金与适体构成的探针溶液中，由于探针溶液中的适体是对应的AβOligomer的aptamer，它能够和AβOligomer形成稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)通过柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金；2)将阿尔茨海默症标志物适体修饰在所述纳米金表面，得到探针；3)将一系列不同浓度的Aβ寡聚体标准液先分别与所述探针反应，再分别与NaCl溶液反应，各所得反应液分别通过紫外检测纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚体浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线；4)将含Aβ寡聚体的待测液按3)步骤通过紫外检测，并依据标准曲线进行分析，即得待测液中Aβ寡聚体的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)通过柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金；2)将阿尔茨海默症标志物适体修饰在所述纳米金表面，得到探针；3)将一系列不同浓度的Aβ寡聚体标准液先分别与所述探针反应，再分别与NaCl溶液反应，各所得反应液分别通过紫外检测纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，建立Aβ寡聚体浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线；4)将含Aβ寡聚体的待测液按3)步骤通过紫外检测，并依据标准曲线进行分析，即得待测液中Aβ寡聚体的浓度。2.根据权利要求1所述的基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法，其特征在于：所述的纳米金尺寸为13nm～15nm。3.根据权利要求1或2所述的基于核酸适体的比色法检测阿尔茨海默症标志物的方法，其特征在于：所述纳米金的制备过程为：将浓度为0.005～0.015wt％氯金酸溶液加热至沸腾后，加入浓度为1.5～2.5wt％的柠檬酸钠溶液进行反应，直至反应液变...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓春艳，刘慧，向娟，钱频，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43