一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明专利技术还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物免疫
，尤其涉及一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，还涉及该全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
技术介绍
巨噬细胞通过吞噬作用从血液中清除病原体和受损或是衰老细胞。细胞表面的CD47可以与巨噬细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用，进而抑制吞噬正常的细胞。CD47是一个广泛的跨膜糖蛋白表达，含有一个免疫蛋白样结构域和5个跨膜区,它们构成了SIRPα的配体,通过NH2端的可变区样结构域结合SIRPα。SIRPα主要表达在髓细胞,包括巨噬细胞、粒细胞、髓系树突状细胞,肥大细胞,以及它们的前体,包括造血干细胞。SIRPα能够通过巨噬细胞抑制宿主细胞吞噬作用,SIRPα通过与表达在宿主靶细胞上的CD47结合形成一个抑制信号，SHP-1可以起负性调节的作用。与CD47抑制正常细胞吞噬功能的作用相一致的研究表明,它是在造血干细胞及其母细胞迁移之前的阶段暂时性调节,这些细胞上CD47的水平决定了吞噬的能力。总之CD47是抑制性受体SIRPα的胞外配体，二者结合通过产生抑制性信号降低巨噬细胞的吞噬活性，从而产生肿瘤的免疫逃逸.目前国内抗CD47的单抗制备技术大多是鼠源，或者进行基因工程改造后进行表达，但是表达量不高或是制备繁琐。本专利采用较为先进的基因工程抗体表达系统，并在表达条件上进行了优化，获得了高特异性和CD47结合的抗体，细胞实验证明在抗体存在时可以促进巨噬细胞对血液肿瘤细胞的吞噬作用。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体。本专利技术的目的又在于提供一种编码上述全人源抗CD47的全分子IgG抗体的DNA分子。本专利技术的目的又在于提供一种含有能编码上述全人源抗CD47的全分子IgG抗体的DNA分子表达载体。本专利技术的目的又在于提供一种被上述的表达载体所转化的宿主细胞。本专利技术的目的还在于提供上述全人源抗CD47的全分子IgG抗体的应用。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究，包括全人源Fab噬菌体抗体库的筛选，抗CD47特异性抗体的纯化，抗CD47全分子抗体IgG的制备、表达及纯化，抗CD47全分子抗体IgG的特性分析，最终获得了一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。优选地，所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。本专利技术还提出的一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链恒定区和重链恒定区，所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，所述的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。本专利技术还提出的一种DNA分子，其编码上述全分子IgG抗体的重链或/和轻链。优选地，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQID NO.1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提出的一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。本专利技术还提出的一种宿主细胞，被上述的表达载体转化。优选地，该宿主细胞可以是被上述的表达载体转化的293Freestyle细胞。本专利技术还提出的上述全分子IgG抗体在制备与CD47相关的肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的用途。本专利技术通过噬菌体抗体库技术筛选到了对CD47具有高度亲和力的人源Fab抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所述抗体的重链和轻链可变区与含有抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗原结合性和在器官移植动物水平具有较好的抗排异反应。本专利技术提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗CD47的全分子全人源单克隆抗体。CD47骨髓来源的血液疾病细胞中广泛表达,而在正常组织中不表达，因此本专利技术的抗CD47抗体可应用于有关CD47阳性的肿瘤的诊断、治疗中。本专利技术以CD47为靶分子，在噬菌体抗体库技术的基础上制备出全分子人源抗体。对制备的人源抗CD47抗体做功能鉴定，显示该抗体能够与CD47特异性结合，体外细胞实验证实抗体能够促进巨噬细胞对CD47阳性的血液肿瘤细胞的吞噬作用。与国内现有的抗CD47鼠源单抗相比，本专利技术制备的是全人源IgG抗体，而且实验证明有很好的特异性及能够明显增强吞噬细胞对CD47阳性血液肿瘤细胞的吞噬作用。本专利技术人通过在抗CD47抗体存在时检测骨髓来源的巨噬细胞对人早幼粒白血病细胞HL-60吞噬实验，结果证明抗CD47抗体可以明显增强巨噬细胞的吞噬作用。附图说明图1为本专利技术实施例1所得纯化全人源抗CD47的全分子IgG抗体的SDS-PAGE检测结果；其中1为蛋白分子量标准品，2为抗CD47抗体，3为抗TLR4抗体，4为细胞培养上清，5为流穿；可见使用Pro.A柱纯化抗CD47抗体纯度高。图2为本专利技术实施例1所得抗CD47抗体的酶联免疫吸附试验检测结果，可见抗CD47抗体与CD47蛋白的结合能力较强。图3为本专利技术实施例1所得抗CD47抗体与CD47的免疫印迹鉴定结果；其中1为抗CD47抗体与CD47阳性的人早幼粒白血病细胞HL-60；2为抗CD47抗体与CD47阴性的大鼠骨髓瘤细胞YB2/0；可见抗体与CD47蛋白有特异性结合能力。图4为本专利技术实施例1所得抗CD47抗体的亲和力检测结果，KD值为3.362×10-10M。图5为本专利技术实施例1所得抗CD47抗体促进巨噬细胞吞噬作用的实验结果对比图。实验结果显示抗CD47抗体可以使80％吞噬细胞发挥吞噬作用。具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1全人源抗CD47的全分子IgG抗体的制备1)用CD47抗原在人源Fab噬菌体库中经过六轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得抗CD47的Fab抗体，然后通过PCR扩增测序获得Fab抗体的可变区序列。2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列，设计引物。3)扩增抗CD47抗体重链、轻链。以上述制备的人源Fab模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全分子人源抗体重链、轻链基因。(1)PCR反应体系如下：反应条件如下：(2)2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。4)双酶切IgG表达质粒IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Lambda)恒定区碱基编码序列。(1)pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板载体的双酶切反应体系如下：反应条件为：37℃酶切过夜。(2)1％琼脂糖凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于，(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于，(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2.根据权利要求1所述全分子IgG抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振卿，朱进，许国贞，刘振云，熊四平，唐奇，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34