一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒，属于畜牧业技术领域，该方法以待测牛的基因组DNA为模板，设计KRT27基因上、下游引物对进行PCR扩增，反应后PCR产物使用Takara限制酶AvaII进行酶切，酶切后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，检测DNA片段为469bp的待测牛为无卷毛基因牛；酶切后DNA片段为195bp、274bp、469bp的检测牛为卷毛基因杂合子牛。本发明专利技术可以对犊牛毛发卷曲情况进行早期鉴定，选育出的牛只可以降低寄生虫风险，具有很好的经济价值。同时毛发卷曲作为直观的表型信息，可作为一种遗传标记，为牛的遗传育种提供指导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于畜牧业
，尤其涉及一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒。
技术介绍
皮肤组织是动物自我保护免受外物侵扰机体的一道天然屏障，皮肤的形成促使了毛囊的发生发育，而毛发是由皮肤组织中毛囊所产生的角质化产物。毛发纤维的形成受毛囊表皮细胞和间质细胞的相互作用调控，并且只在毛发生长周期的初期发生，而在退行期停止，最后在休止期静止。毛发的表型特征包括毛发的长度、密度、形状及颜色则会随着动物机体的不同部位表现出不同的特征。不同物种，或同一物种不同种属其被毛表型差异较大，具体表现在毛发的色泽、长度、细度、密度、品质、形态结构(卷曲与否)等等。毛发形态中的卷曲状况通常可利用直毛(straight hair)、卷毛(curly hair)和波浪形卷毛(wavy hair)词语进行描述。由于种属差异，动物被毛的分子调控机制也较为复杂，不同基因或信号分子都可能会调控这一表型性状。波浪形毛发以围绕于副皮质巨原纤维周围的正皮质和仲皮质巨原纤维间的相互交织为特征，随着毛发卷曲程度的增加，仲皮质就会消失，并形成正皮质细胞。KRT是keratin intermediate filament的缩写形式，又可写为KRT-IF(角蛋白中间丝蛋白)，是角蛋白家族的重要成员，是形成毛发、角和指甲的主要成分。角蛋白是多种氨基酸聚成的多聚长链物，其一级结构分为主链和侧链，主链通过肽键连结构成的多缩氨酸链，侧链由20多种不同α氮基酸构成；各链的半胱氨酸中SH氧化形成二硫键，使肽键之间形成稳定交互网络，侧链的种类和性质决定了角蛋白整体的物理和化学性质。角蛋白分子间作用形式随R基的不同而异，主要有氢键、盐式键和二硫键，其中以二硫键为主要作用形式[Eckhart L,2008]。KRT-IF有I型(酸性)和II型(碱性)两种类型，KRT27基因属于I型基因。I型KRT-IF基因含有4～5kb个碱基对，有8个外显子。对猫的KRT71基因进行测序发现，存在一个600BP的特异单倍型与猫的卷毛性状显著性相关[Barbara Gandolfi,2012]。在雷克斯小鼠中，KRT71基因剪切位点的一个7bp的缺失，能够导致小鼠毛发成波浪状卷曲[Takashi KURAMOTO,2010]。在人上，KRT71基因外显子1处存在c.422T>G的杂合突变，导致编码氨基酸赖氨酸突变为天冬酰胺，最终使人患常染色体显性绵毛症(Autosomal-dominant woolly hair,ADWH)[Yutaka Shimomura,2010]。养牛业实际生产中，卷曲毛发的牛更易寄生蜱虫及其他寄生虫，从而导致牛的生长发育迟缓，产奶量和繁殖性能下降等，影响其经济效益。因此，能够早期、快速、准确的鉴定犊牛成年后的毛发卷曲情况，从而有针对性的选择牛只，对实际生产具有指导意义。同时毛发卷曲作为一种表型信息，是一种可利用的遗传标记，通过分子手段并且结合系谱分析开发一个简单、快速、可靠性强的检测携带者试剂盒，对于牛分子育种来说具有实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种牛卷毛基因快速筛选的引物、方法及试剂盒。为了实现上述目的，采用如下技术方案：一种牛卷毛基因快速筛选的引物，以KRT27基因g.41636961C>G位点突变为检测对象而设计的上游引物KRT27F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列为：SEQ ID NO.2。一种牛卷毛基因快速筛选的方法，包括使用上述引物的步骤。一种牛卷毛基因快速筛选的方法，其步骤如下：DNA提取：采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA；PCR扩增反应：使用上述的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；扩增产物用Takara限制酶AvaII进行酶切，然后进行凝胶电泳检测；判断结果。所述的判断结果具体为：酶切后凝胶检测酶切DNA片段为469bp的待测牛为无卷毛基因牛；酶切后DNA片段为195bp、274bp和469bp的检测牛为卷毛基因杂合子牛。优选：所述PCR扩增反应采用25μl PCR扩增反应体系为：模板DNA(100ng/μl)1μl，上游引物KRT27F、下游引物KRT27R各(10μmol/L)0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用双蒸水(ddH2O)补至25μl；PCR扩增反应条件为:94℃变性4min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；10℃保存。优选：所述酶切反应采用30μl AvaII酶切反应体系为：PCR扩增产物10μl；Buffer 2μl；Takara限制酶AvaII1μl；ddH2O 17μl，酶切反应条件为：30℃消化60min。优选：酶切片段用质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳。一种牛卷毛基因快速筛选的试剂盒，包括以KRT27基因g.41636961C>G位点突变为检测对象而设计的上游引物KRT27F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列为：SEQ ID NO.2，Taq PCR MasterMix，Takara限制酶AvaII，Takara缓冲液。优选：一种牛卷毛基因快速筛选的试剂盒：上下游引物KRT27F和下游引物KRT27R(10μmol/L)；2×Taq PCR MasterMix；U/μL TakaraAvaII；10×Takara缓冲液；ddH2O；2000bp DNA Ladder Marker。其中2×Taq PCR MasterMix(含染料)是由Taq DNA Polymerase(0.05units/μl)、MgCl2(4mM)、dNTPs(0.4mM)构成。本专利技术的有益效果：本专利技术的专利技术人对荷斯坦牛、西门塔尔牛、南阳牛、新疆褐牛、鲁西黄牛共计5个品种48个个体的KRT27基因第1外显子进行扩增后测序，共发现4处SNP，分别为g.41637129C>T、g.41637058G>C、g.41637074G>C、g.41636961C>G。将测序序列所得SNPs及单倍型组合与卷毛表型进行关联分析，发现g.41636961C>G位点只在西门塔尔牛中出现，且与卷毛表型一一对应。本专利技术根据角蛋白中间丝蛋白KRT27基因(NCBI参考序列AC_000176)g.41636961C>G位点突变，产生了AvaII限制性酶切位点的原理，从而建立起筛查牛卷毛基因携带者的PCR-RFLP方法。通过分析后设计针对含有突变位点的引物，特异性扩增出469bp的牛KRT27基因含有上述位点的片段，再经限制性内切酶AvaII酶切，扩增片段中不含有AvaII酶切位点的为无卷毛基因牛(CC型)，经凝胶电泳后产生DNA片段为469bp；含有一个AvaII酶切位点的为卷毛基因杂合子牛(GC型)，经凝胶电泳后产生DNA片段为195bp、274bp、469bp。本专利技术筛查方法操作简单、快捷、费用低廉、可靠性高。同时根据筛查方法开发出相应地检测试剂盒，使操作更加简单化、快速、灵敏、可靠性强，一般生产中常规实验室都有条件完成，这一专利技术可以对牛只毛发卷曲情况进行早期鉴定，降低寄生虫患病几率，预防寄生虫传染病，从而提高养殖经济效益本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛卷毛基因快速筛选引物，其特征是：以KRT27基因g.41636961C>G位点突变为检测对象而设计的上游引物KRT27F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列为：SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种牛卷毛基因快速筛选引物，其特征是：以KRT27基因g.41636961C>G位点突变为检测对象而设计的上游引物KRT27F序列为：SEQ ID NO.1，下游引物KRT27R序列为：SEQ ID NO.2。2.一种牛卷毛基因快速筛选的方法，其特征是：包括使用权利要求1所述引物的步骤。3.一种牛卷毛基因快速筛选的方法，其特征是：步骤如下：DNA提取：采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA；PCR扩增反应：使用上述的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；扩增产物用Takara限制酶AvaII进行酶切，然后进行凝胶电泳检测；判断结果。4.如权利要求3所述的一种牛卷毛基因快速筛选的方法，其特征是：所述的判断结果具体为：酶切后凝胶检测酶切DNA片段为469bp的待测牛为无卷毛基因牛；酶切后DNA片段为195bp、274bp和469bp的检测牛为卷毛基因杂合子牛。5.如权利要求3所述的一种牛卷毛基因快速筛选的方法，其特征是：所述PCR扩增反应采用25μl PCR扩增反应体系为：模板DNA 1μl，上游引物KRT27F、下游引物KRT27R各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，用双蒸水补至25μl；PCR扩增反应条件为:94℃变性4min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，这一步共35个循环；72℃保持10min；10℃保存。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜强，黄金明，王秀革，张燕，鞠志花，王长法，孙艳，仲跻峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37