本发明专利技术公开了一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）抗体包被；（2）CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；（3）免疫捕获‑环式等温扩增检测；（4）免疫捕获‑环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，孵育，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中孵育，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV和PVY特异反转录引物，反转录反应在42℃下进行60min，然后吸出10μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，整个反应在65℃下进行90min。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的CMV、PVY快速检测方法。
技术介绍
目前，基于免疫学原理的酶联免疫（ELISA）和基于分子生物学原理的聚合酶链式扩增（PCR）是对植物病毒病原的检测和诊断主要方法。最近几年，环式等温扩增技术（LAMP）发展迅速，成为的植物病原检测新的检测手段。但是，不可否认的是，LAMP虽然可以不依靠于复杂设备实现对病原物的高灵敏检测，然而核酸提取步骤使得LAMP操作与常规分子生物学的PCR检测相比，没有明显的简化。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种型的CMV、PVY快速检测方法，以解决现有检测手段中依靠复杂设备和步骤复杂的问题。本专利技术的技术方案是：一种新的CMV、PVY快速检测方法，包含以下步骤：（1）抗体包被：PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，2-8℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用；（2）CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；（3）免疫捕获-环式等温扩增检测，样品匀浆：取0.1-0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液，然后研磨匀浆，离心取上清液；（4）免疫捕获-环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1-3h，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中变性5-10min，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl，转录反应45min至1h，然后吸出5-20μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，个反应在60-65℃条件下进行60-90min。步骤（1）中所述的引物为：引物名称靶标引物序列F3 outer primerCMVTGATTCTACCGTGTGGGTGB3 outer primerCMVCGGCGTACTTTCTCATGTCFIP inner primerCMVGCGAACATAGCAGAGATGGCG_GACAGTCCGCAAAGTTCCTGBIP inner primerCMVCAGTATGCAGCATCCGGAGTC_CCGCATCGCCGAAAGATCAF3 outer primerPVYCGAAATCTGCGGGATGTGGB3 outer primerPVYAGACATCCTCGGTGGTGTFIP inner primerPVYTCCCTAGCCCTCACTGGTGTTC_TTAGCGCGTTATGCCTTTGABIP inner primerPVYGCAGCATTGAAATCAGCCCAA_GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT所述的抽提缓冲液为2% polyvinylpyrrolidone、0.2% powdered egg albumin和phosphate -buffered saline, pH7.4。所述的CMV反转录引物TGTGGGAATGCGTTGGTG；PVY反转录引物TTTATCTAAGACTTAATAATGCG。步骤（4）中所述的试剂，其终浓度分别为Tris-HCl 20mM，KCl 10 mM，(NH4)2SO4 10 mM，甜菜碱1.0 M，外侧正向引物和外侧反向引物各0.2μM，内侧正向引物和内侧反向引物各1.6μM，Mg2+8mM，dNTP mix0.6mM，Bst DNA聚合酶8U。本专利技术的有益效果：本专利技术通过将免疫学技术和分子生物学技术相结合，发挥单克隆抗体高特异性和LAMP技术高灵敏性的优点，开发的免疫捕获-环式等温扩增技术不仅可以在不依赖与核酸提取的步骤和复杂实验设备情况下对病原微生物进行高灵敏检测，还可以大大增加检测的特异性。附图说明图1为马铃薯Y病毒提纯病毒粒子的电镜照片；图2为CMV病毒提纯病毒粒子的电镜照片；图3为2 PVY单抗的Western blot分析，M：蛋白Maker，1和2：2个感染PVY的普通烟病叶组织；3和4：分别为健康的马铃薯和普通烟叶片组织；图4为CMV单抗的Western blot分析，M：蛋白Maker；1：感染CMV的马铃薯植株；2：健康的马铃薯植株；图5为免疫捕获环式等温扩增体系建立验证试验结果；图6为灵敏性试验结果。具体实施方式一、CMV和PVY 单抗的制备 材料与方法病毒材料、培养基和抗体、膜、生化试剂PVY和CMV毒源由贵州省烟草科学研究院提供，经RT-PCR和核酸测序鉴定后繁殖于植物培养箱中生长的普通烟植物。RPMI-1640培养基、HAT、HT、抗体类型及亚类鉴定试剂盒、碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗购自Sigma公司。硝酸纤维素膜购自Amersham Pharmacia公司。NBT/BCIP底物及TMB显色底物购自Promege公司，其他试剂为国产分析纯产品。 PVY和CMV病毒粒子的提纯将PVY和CMV贵州分离物接种于三生烟上，两周后采集微量病叶进行RT-PCR检测，收集RT-PCR检测的呈阳性的三生烟组织200g，提纯PVY和CMV病毒粒子。杂交瘤细胞的制备以提纯的PVY和CMV病毒粒子作为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，前三次均用50µg/只的病毒量免疫，第四次加强免疫的病毒量为100µg/只。腹水制备和抗体纯化用饱和硫酸铵盐析法纯化腹水单克隆抗体，步骤如下：1)取适量腹水单抗与3倍体积的生理盐水混匀后，边搅拌边向其缓慢滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌混匀后放置4℃3 h，待其充分沉淀后12000rpm离心15min；2)弃上清，用生理盐水悬浮沉淀，然后移入预先处理好的透析袋中，放入0.01 M PBS缓冲液中4℃下缓慢搅拌透析，每隔2 h换一次PBS 缓冲液；3)将透析好的纯化抗体，取1 µL用NanoDrop紫外分光仪测定其IgG的含量，分装于离心管中后于-80℃超低温冰箱冻存待用。抗体腹水效价的测定和类型及亚类鉴定以提纯的病毒(1µg/mL)或植物组织研磨液1:30倍稀释（w/v， g/mL）后作为抗原包被酶标板，倍比稀释的单抗腹水为一抗，AP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，用间接ELISA方法测定腹水效价。采用美国 Sigma公司的抗体类型和亚类鉴定试剂盒分析单克隆抗体的抗体类型及亚类。实验结果病毒粒子的提纯提纯的CMV和PVY经紫外分光仪测得其浓度别为5.6mg/mL和7.46 mg/mL，经 3 %磷钨酸负染色后在电镜下观察，发现病毒提纯液中有较高浓度病毒粒子，其具有CMV和PVY粒子的典型形态和大小(图1和图2)。细胞的融合、杂交瘤的筛选和克隆经过四次免疫后取小鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在PEG下融合，用HAT培养基筛选培养12d后，倒置显微镜观察发现22块96孔细胞板的融合率为96% 。当杂交瘤细胞生长至覆盖孔底20-30%时，用间接 ELISA方法检测培养上清中的抗体。检测结果发现，共有298个孔呈阳性反应，阳性率为14%。经特异性分析以及3次细胞有限稀释法克隆，最终获得4株能稳定分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株，5株能稳定分泌CMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：包含以下步骤：抗体包被：PCR管使用2%‑5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，2‑8℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用；CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；免疫捕获‑环式等温扩增检测，样品匀浆：取0.1‑0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液，然后研磨匀浆，离心取上清液；免疫捕获‑环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1‑3h，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中变性5‑10min，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl，转录反应45min至1h，然后吸出5‑20μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，个反应在60‑65℃条件下进行60‑90min。
【技术特征摘要】
1.一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：包含以下步骤：抗体包被：PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，2-8℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用；CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；免疫捕获-环式等温扩增检测，样品匀浆：取0.1-0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液，然后研磨匀浆，离心取上清液；免疫捕获-环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1-3h，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中变性5-10min，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl，转录反应45min至1h，然后吸出5-20μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，个反应在60-65℃条件下进行60-90min。2.根据权利要求1所述的一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述的引物为：引物名称靶标引物序列F3 outer primerCMVTGATTCTACCGTGTGGGTGB3 outer primerCMVCGGCGTACTTTCTCATGTCFIP inner primerCMVGCGAACATAGCAGAGATGGCG_GACAGTCCGCAAAGTTCCTGBIP inner primerCMVCAGTATGCAGCATCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾蒙骜，夏范讲，郭玉双，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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