头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的头孢菌素酰化酶突变体为如下a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白质：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；a4)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质。实验证明，本发明专利技术所提供的头孢菌素酰化酶突变体提高了对头孢菌素C的水解活性，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用。
技术介绍
β-内酰胺类抗生素作为医药行业中最广泛使用的抗生素，每年产量达3万吨，占整个抗生素市场的65％。在抗生素生产过程中，抗生素母核的获得至关重要，如6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid，6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是合成β-内酰胺类抗生素的起点。通常，抗生素母核通过由细菌发酵得到的天然抗生素水解得到，如6-APA可由青霉素G(Penicillin G，PG)水解得到，7-ACA可由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)水解得到。以7-ACA作为母核的头孢类抗生素是一类高效、低毒、临床广泛应用的β-内酰胺类抗生素。但是，传统的化学法制备7-ACA工艺流程复杂，通常都需要活化、缩合、保护和去保护的过程，而且反应条件苛刻，能耗高，容易引入杂质。相比而言，生物法采用酶作为催化剂，在水环境中进行反应，条件温和，无需中间产物的提纯过程，且由于酶具有很好的特异性和选择性，并不要求使用纯的反应物，从而大大降低工艺的复杂性和生产成本，因此生物法在β-内酰胺类抗生素工业生产中逐渐成为主导方法。目前工业中广泛采用的CPC水解工艺是由D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)和戊二酰基转移酶(glutaryl-7-ACA acylase，GA)混合的两步酶法。反应步骤为：首先DAAO将CPC氧化成α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)，并产生过氧化氢和氨，随后过氧化氢迅速与AKA-7-ACA反应生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid，GL-7-ACA)；最后，GA将GL-7-ACA水解得到7-ACA。由于两步酶法水解CPC的第一步反应中会生成副产物过氧化氢，对酶的稳定性造成不可忽视的影响，造成酶的使用批次降低。因此，探索一步酶法直接催化CPC水解的研究对工业生产意义重大。但是，实现一步酶法水解CPC制备7-ACA并不容易。目前，自然界中尚未发现以CPC为天然底物的酶，而已知能够水解CPC的酰化酶均以GL-7-ACA为天然底物，其催化CPC水解的活性和特异性都非常低，远远达不到工业生产的要求。例如，从假单胞菌N176中提取的戊二酰基转移酶，对CPC的水解活性只有对其天然底物GL-7-ACA的1/250(二者的Vmax/Km分别为0.06和15.1U·mg-1·mM-1)(Li Y,Chen J,Jiang W,Mao X,Zhao G,Wang E.In vivo post-translational processing and subunit reconstitution of cephalosporin acylase from Pseudomonas sp.130.European Journal of Biochemistry 1999；262:713-719.)，尽管如此，该酶也已经是天然酶中对CPC活性较高的了。在过去二十多年的研究中，不断有学者测定出新的头孢菌素酰化酶的晶体结构，并对已有基因序列进行突变，以此改善对CPC的水解活性，使其能够应用于β-内酰胺类抗生素的工业生产中来。1991年，Aramori等人成功测定了头孢菌素酰化酶N176的基因序列，其属于第III类头孢菌素酰化酶。1995年，Ishii等人基于已有的头孢菌素酰化酶N176的基因序列，得到了CPC催化活性相对于天然酶提高了1.7倍的单点突变Metβ31Phe，对头孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)为0.06U·mg-1·mM-1。2005年，Pollegioni等人通过易错PCR突变、分子建模方法、饱和突变及定向进化等方法，在引入已有突变Metβ31Phe的基础上，进一步筛选出了4倍于起始突变体(单点突变Metβ31Phe)催化活性的两点突变Hisβ57Ser/Hisβ70Ser，对头孢菌素C的水解活性(Vmax/Km)为0.227U·mg-1·mM-1。但是，上述突变体中，酶的催化活性远远达不到工业生产的要求，酶的稳定性也较差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何生产7-氨基头孢烷酸。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种蛋白质。本专利技术所提供的蛋白质，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)或a7)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；a5)在序列表中序列6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a6)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；a7)将a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。序列表中序列2可由774个氨基酸残基组成。序列表中序列4可由784个氨基酸残基组成。序列表中序列6可由774个氨基酸残基组成。序列表中序列8可由784个氨基酸残基组成。为了使a1)或a4)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2或序列表中序列6所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a7)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a7)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a7)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5’末端起第9至2330位、序列表中序列3自5’末端起第3至2354位、序列表中序列5自5’末端起第9至2330位或序列表中序列7自5’末端起第3至2354位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：b1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第3至2354位所示的DNA分子；b3)核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子；b4)核苷酸序列是序列表中序列7自5’末端起第3至2354位所示的DNA分子；b5)与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；b6)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)或a7)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；a5)在序列表中序列6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a6)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；a7)将a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)或a7)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；a4)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；a5)在序列表中序列6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a6)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；a7)将a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)所示的DNA分子：b1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列3自5’末端起第3至2354位所示的DNA分子；b3)核苷酸序列是序列表中序列5自5’末端起第9至2330位所示的DNA分子；b4)核苷酸序列是序列表中序列7自5’末端起第3至2354位所示的DNA分子；b5)与...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玉山，田野，黄小强，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11