荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，通过对荔枝果肉中原花青素、黄酮类物质等4段不同的酚类成分的分离，获得这4段酚类成分对油酸诱导的肝细胞内脂质聚集的抑制作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品加工领域，尤其涉及一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法。
技术介绍
荔枝是亚热带地区的主要特色水果，因其果皮鲜艳美观、肉汁细腻香甜而深受国内外消费者的喜爱，被誉为“果中珍品”。我国是荔枝的主产国，种植面积和产量均居世界第一。广东省作为荔枝的主产区其产量占全国荔枝总产量的60％以上。由于荔枝上市时间集中，且保鲜时间短，鲜销市场压力巨大。如何开展荔枝的精深加工，缓解鲜销市场压力，提高荔枝的附加值成为一个亟待解决的问题。自古以来，很多古医书中都记载有荔枝的各种保健作用，《本草纲目》记载：“常食荔枝能补脑健身，治疗瘰疬，开胃益脾；干制能补元气，可作为产妇及老弱者的补品”；《滇南本草》称其“暖补脾精，滋补肝血”。然而，截至目前，对于荔枝中具有保健作用的物质基础以及其发挥生物活性的作用机制还缺乏清晰的认识。已有研究表明，荔枝果肉中富含多酚类物质，并发现其具有减轻拘束应激引起的小鼠肝脏损伤、抑制高脂膳食诱导的小鼠肝脏脂肪变性，降低血脂水平等作用。然而，在上述研究中，所采用的都是荔枝果肉多酚的提取物，其多酚类成分组成复杂。酚类物质是一大类植物次生代谢产物，不同的化合物因其结构的差异活性会有明显的不同。上述研究虽然发现了荔枝果肉多酚具有护肝、降血脂等的生物活性，其中具体的作用成分却并不明确。为了探明某些原料中的有效活性成分，传统的研究思路是利用植物化学的方法将其逐步分离纯化制备出一个个的单体，再对其活性逐一进行比较，找出其中活性最强的一个或几个成分，认定为该原料中主要的活性成分。然而，近来的研究观点认为植物活性物质发挥药理活性的往往不是某种单一的化学成分而是一组成分群的共同作用。采用上述方法会割裂成分间的有机关联与交互作用，难以体现其产生的协同或拮抗等共同作用特点。而且，这样的研究工作操作繁杂，研究成本高，甚至可能因实验条件限制而无法实现。若将荔枝果肉分成不同的酚类成分群，对其活性分别进行比较不仅考虑了某些含量较低或单独作用活性较弱的成分对主要活性成分可能具有的协同增效作用，确定出更接近提取物作用效果的有效酚类成分群，而且较逐个分离化合物可以提高工作效率。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的在于克服现有技术的不足，提供一种简化的荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，解决化合物逐一分离制备荔枝果肉多酚活性成分烦琐耗时，且容易忽略化合物间的协同作用的问题。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备荔枝果肉多酚提取物；S2、将步骤S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成浓度600mg/mL溶液，再用蒸馏水稀释至终浓度为1mg/mL；S3、上样于C18硅胶层析柱后，依次采用体积百分比浓度为1～2％的乙腈水(v/v)和组合液进行梯度洗脱，收集流分，并用HPLC检测分析，合并图谱组成相近的流分，所述组合液包括含有0.2％冰乙酸的体积百分比浓度为10～35％的甲醇水溶液；收集1％、2％乙腈洗脱液和10％、15％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液洗脱液，单独收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液，单独收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液；S4、将步骤S3中收集的洗脱液依次分别用蒸馏水稀释1.5～2倍后，上样到HPD100型大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水冲洗，再用100％甲醇洗脱并收集甲醇洗脱液，分别减压回收甲醇后冷冻干燥，得到四个组成不同的荔枝果肉酚类成分群，F1、F2、F3和F4；S5、合并F2和F3。其中，步骤S3中10％、15％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液是指用含有体积百分比浓度10％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液以及含有体积百分比浓度15％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分别洗脱后收集；20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液是指用含有体积百分比浓度20％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液洗脱后收集；25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液合并液是指用含有体积百分比浓度25％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液以及含有体积百分比浓度30％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分别洗脱后收集；35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脱液是指含有体积百分比浓度35％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分别洗脱后收集。荔枝果肉多酚提取物经过AB-8大孔树脂初步纯化后，成分还是比较复杂，里面的酚类成分有些在抑制肝细胞脂质聚集中有效果，有些没有活性，但是如果一一进行分离研究又非常的烦琐，而且很有可能有些成分单独不起作用却能够增强其它成分的作用，如果采用一一分离的方法，这些辅助性化合物的作用就会被忽视，因此，最终分离到的有效成分的作用并不能达到粗提物共同作用的效果。基于这样的一个思路，我们想要专利技术一种简化的可以分离出主要活性成分的植物活性物质纯化方法。将荔枝果肉多酚提取物上硅胶柱，利用不同类型的化合物因其极性等的差异与硅胶柱的吸附力不同，采用不同极性的洗脱剂进行分步洗脱将其分离。结合液相色谱检测和活性分析，发现用1％、2％乙腈洗脱液和10％甲醇水、15％甲醇水洗脱下来的成分活性均较低，这一部分进行合并(F1)；20％甲醇水洗脱液部分(F2)，还有25％和30％甲醇水洗脱液部分(F3)的活性都比较好，35％甲醇水洗脱液部分(F4)活性也比较差。后续采用HPD100大孔吸附树脂处理的过程主要是为了脱去洗脱液中的水分。由于上述洗脱液水分含量较高，如果进行旋蒸和浓缩处理的话，因为酚类物质对温度等较敏感，会造成较多的降解，同时能耗也非常大。因此，将洗脱液上到大孔吸附树脂上，洗脱液中的多酚类成分会与树脂进行结合，再利用甲醇将结合的酚类物质洗脱下来，甲醇洗脱液可以较快的旋蒸去除有机溶剂进而得到目标分离物质。在大孔树脂上样前对洗脱液用蒸馏水做1.5～2倍稀释，目的是为了降低上样液中有机溶剂的浓度，因为有机溶剂含量高时会影响酚类物质与大孔树脂的吸附，造成酚类物质流失。在确定有效活性组分的过程中，考虑到有些成分单独无明显活性但是可能会其它对其它成分的协同增效作用，因此在确定出F2和F3活性较好后，还进一步参照各部分在粗提物中的构成比例进行配合，观察在F2和F3的基础上再添加F4后活性是否有变化，发现没有进一步提高其活性，因此，确定出F2和F3为荔枝果肉多酚抑制肝细胞脂质聚集的主要酚类成分，所以最后对这两部分进行了合并。进一步地，步骤S1的具体步骤如下：S11、制备荔枝果肉多酚粗提液：新鲜荔枝果肉浸泡在0～4℃预冷的95％食用酒精中，均质，离心后收集上清液，于45～55℃条件下减压回收乙醇，残留的水溶液为荔枝果肉多酚粗提液；此部分主要是旋蒸的温度会影响多酚的稳定性，温度过高容易造成多酚氧化和降解S12、将步骤S11中制得的荔枝果肉多酚粗提液经过大孔树脂吸附后，蒸馏水洗脱以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用65～75％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，于45～55℃减压浓缩，得到深黄色浓缩液，真空冷冻干燥后即为荔枝果肉多酚提取物。此步骤主要是大孔树脂类型会影响纯化酚类物质的得率，优选AB-8但不局限于AB-8这一种树脂，HPD826等几种树脂都有较好的分离效果；旋蒸的浓度如上会本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备荔枝果肉多酚提取物；S2、将步骤S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成浓度600mg/mL溶液，再用蒸馏水稀释至终浓度为1mg/mL；S3、上样于C18硅胶层析柱后，依次采用体积百分比浓度为1~2％的乙腈水（v/v）和组合液进行梯度洗脱，收集流分，并用HPLC检测分析，合并图谱组成相近的流分，所述组合液包括含有0.2％冰乙酸的体积百分比浓度为10~35％的甲醇水溶液；收集1％、2％乙腈洗脱液和10%、15％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液合并液洗脱液，单独收集20％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液，收集25％和30％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液合并液，单独收集35％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液； S4、将步骤S3中收集的洗脱液依次分别用蒸馏水稀释1.5~2倍后，上样到HPD100型大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水冲洗，再用100％甲醇洗脱并收集甲醇洗脱液，分别减压回收甲醇后冷冻干燥，得到四个组成不同的荔枝果肉酚类成分群， F1、F2、F3和F4；S5、合并F2和F3。

【技术特征摘要】
1.一种荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备荔枝果肉多酚提取物；S2、将步骤S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成浓度600mg/mL溶液，再用蒸馏水稀释至终浓度为1mg/mL；S3、上样于C18硅胶层析柱后，依次采用体积百分比浓度为1~2％的乙腈水（v/v）和组合液进行梯度洗脱，收集流分，并用HPLC检测分析，合并图谱组成相近的流分，所述组合液包括含有0.2％冰乙酸的体积百分比浓度为10~35％的甲醇水溶液；收集1％、2％乙腈洗脱液和10%、15％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液合并液洗脱液，单独收集20％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液，收集25％和30％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液合并液，单独收集35％甲醇/0.2%冰乙酸水洗脱液； S4、将步骤S3中收集的洗脱液依次分别用蒸馏水稀释1.5~2倍后，上样到HPD100型大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水冲洗，再用100％甲醇洗脱并收集甲醇洗脱液，分别减压回收甲醇后冷冻干燥，得到四个组成不同的荔枝果肉酚类成分群， F1、F2、F3和F4；S5、合并F2和F3。2.根据权利要求1所述荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤如下：S11、制备荔枝果肉多酚粗提液：新鲜荔枝果肉浸泡在0~4℃预冷的95％食用酒精中，均质，离心后收集上清液，于45~55℃条件下减压回收乙醇，残留的水溶液为荔枝果肉多...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞芬，董丽红，张名位，肖娟，邓媛元，黄菲，魏振承，张雁，马永轩，唐小俊，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广州力衡临床营养品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44