用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9001的核酸序列及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9001的核酸序列及其检测方法，所述大豆植物的核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列。本发明专利技术转基因大豆事件DBN9001对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件DBN9001的DNA分子。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9001的核酸序列及其检测方法，特别是涉及一种耐受草甘膦和草铵膦的大豆植物DBN9001和检测生物样品中是否包含特定转基因大豆事件DBN9001的DNA分子的方法。
技术介绍
N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘膦，是一种内吸传导型慢性广谱灭生性除草剂。草甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争性抑制剂，可抑制PEP和3-磷酸莽草酸这两种底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的转化，从而阻断芳香族氨基酸合成前体-莽草酸的合成途径，使蛋白质的合成受到干扰导致植物和细菌死亡。草甘膦耐受性可以通过表达修饰的EPSPS来实现。修饰的EPSPS对草甘膦具有更低的亲和性，因而在草甘膦存在的情况下，EPSPS保持了它们的催化活性，即获得了草甘膦耐受性。大豆(Glycine max)是世界五大主栽作物之一。在大豆生产中除草剂耐受性是一项重要的农艺性状，特别是对草甘膦除草剂的耐受性。大豆对草甘膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草甘膦除草剂耐受型基因(EPSPS，CP4)在大豆植物中表达而获得，例如大豆事件GTS40-3-2、大豆事件MON89788等。草甘膦耐受性耕种系统的普遍采用和草甘膦使用的日益增加已经导致近年来草甘膦抗性杂草的流行。在种植者面对草甘膦抗性杂草或向更难以控制的杂草物种转变的地区，种植者可以通过与能够控制遗漏杂草的其他除草剂混合或交替使用来补偿草甘膦的弱点。草铵膦是膦丝菌素类除草剂中的一种非系统性、非选择性除草剂。主要用于一年生或多年生阔叶杂草的出土后控制，是通过L-膦丝菌素(草铵膦中的活性成分)对谷氨酰胺合酶(一种对于植物中的氨解毒必需的酶)的不可逆抑制来控制杂草的。与草甘膦杀根不同，草铵膦先杀叶，通过植物蒸腾作用可以在植物木质部进行传导，其速效性间于百草枯和草甘膦之间。从链霉菌分离的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)通过乙酰化催化L-膦丝菌素转化为其无活性形式。表达PAT的植物优化形式的基因已经在大豆中使用以赋予大豆对草铵膦除草剂的耐受性，例如大豆事件A5547-127。因此与草铵膦耐受性性状组合使用草铵膦除草剂可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的非选择性手段。在未来，随着转基因抗虫大豆的推广以及大面积种植，少量存活下来的昆虫/害虫经过几代繁殖后，可能产生抗性。转基因除草剂耐受性大豆作为非抗虫转基因大豆，与转基因抗虫大豆以一定比例一并种植，可以延缓昆虫/害虫产生抗性。已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地的生长条件。能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9001的核酸序列及其检测方法，转基因大豆事件DBN9001对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因大豆事件DBN9001的DNA分子。为实现上述目的，本专利技术提供了一种具有以下核酸序列的核酸分子，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。优选地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。进一步地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。更进一步地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:5或其互补序列。所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因大豆事件DBN9001中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9001的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因大豆事件DBN9001中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9001的存在。本专利技术中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:1的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1的扩增产物时，可以诊断转基因大豆事件DBN9001或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其他不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本专利技术中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有以下核酸序列的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种具有以下核酸序列的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。2.根据权利要求1所述核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:5或其互补序列。5.一种检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，包括：使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；进行核酸扩增反应；和检测所述目标扩增产物的存在；所述目标扩增产物包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。6.根据权利要求5所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述目标扩增产物包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。7.根据权利要求5或6所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述目标扩增产物包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。8.根据权利要求5-7任一项所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，至少一种所述引物包括权利要求1-5任一项所述核酸序列或其片段或者与之互补的序列。9.根据权利要求8所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10；所述第二引物选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。10.一种检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，包括：使待检测样品与探针接触，所述探针包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。11.根据权利要求10所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。12.根据权利要求10或11所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针包含选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。13.根据权利要求10-12任一项所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。14.一种检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，包括：使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；和检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定草甘膦耐受性和/或草铵膦耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。15.根据权利要求14所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。16.根据权利要求14或15所述检测样品中转基因大豆事件DBN9001的DNA存在的方法，其特征在于，所述标记物核酸分子包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。17.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包括SEQ ID NO:3的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸，其可以作为对于转基因大豆事件DBN9001或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王登元，于彩虹，张成伟，韩超，李晓娇，姜自芹，张良君，吴竹筠，田康乐，鲍晓明，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11