本发明专利技术提供一种表达载体及其高效表达和制备人胱抑素C蛋白的方法，表达载体，包括哺乳动物表达载体和CD33蛋白信号肽的编码基因，所述CD33蛋白信号肽的编码基因的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述方法包括以下步骤：1)将CD33蛋白信号肽的编码基因插入哺乳动物表达载体中，得到重组人胱抑素C表达载体，所述CD33蛋白信号肽的编码基因如SEQ ID NO:1所示；2)再将所述重组人胱抑素C表达载体和宿主细胞转染，得到转基因细胞；3)再将所述转基因细胞进行表达，纯化，得到重组人胱抑素C蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种表达载体及其高效表达和制备人胱抑素C蛋白的方法。
技术介绍
胱抑素C(CysC)又称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。CysC被广泛用于糖尿病、儿科疾病、肾移植以及脊髓损伤患者的肾功能的监测。此外，它在脑血管疾病、心脏疾病、肿瘤以及肝纤维化等方面也也体现了较为广阔的应用前景。在早期诊断肾脏损伤方面，CysC具有较高的敏感性，是迄今为止基本能够满足肾小球滤过率(GFR)理想内源性标志物要求的物质，因而，联合其他诊断指标对肾脏疾病的早期诊断有重要临床意义。但是由于某些技术上的缺乏，导致目前国内市场上采用的CysC诊断试剂及标准品主要由国外公司提供，价格昂贵，使病人和社会医疗成本较高，目前临床应用较少。目前已公开了一些人胱抑素C蛋白的制备方法，但多是利用原核表达系统表达，缺乏人胱抑素C蛋白后加工与修饰。此外，利用真核表达系统制备的蛋白收率又比较低，约3mg/L,成本较高，不利于大规模的生产及应用。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种表达载体及其高效表达和制备天然人胱抑素C蛋白的方法，从而可以使人胱抑素C蛋白的产量提高7-8倍，并且方法简单，成本低。一方面，本专利技术提供一种重组人胱抑素C表达载体，包括哺乳动物表达载体和CD33蛋白信号肽的编码基因，所述CD33蛋白信号肽的编码基因的序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。优选地，所述哺乳动物表达载体为pcDNATM3.3-TOPO、PTT5或pcDNA4/His A。优选地，所述CD33蛋白信号肽的序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。优选地，所述表达载体中还包括Kozac序列，所述Kozac序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，该Kozac序列的引入能够增强真核基因翻译效率。另一方面，本专利技术还提供一种新表达载体pcDNATM3.3-TOPO-CD33，包括上述重组人胱抑素C表达载体。优选地，所述细胞为HEK293细胞、NSO细胞或CHO细胞。还一方面，本专利技术还提供一种重组人胱抑素C表达载体在用于制备重组人胱抑素C蛋白中的应用。又一方面，本专利技术还提供一种细胞在用于制备重组人胱抑素C蛋白中的应用。再一方面，本专利技术还提供一种重组人胱抑素C蛋白的制备方法，包括以下步骤:1)将CD33蛋白信号肽的编码基因插入哺乳动物表达载体中，得到重组人胱抑素C表达载体，所述CD33蛋白信号肽的编码基因如SEQ ID NO:1所示；3)再将所述重组质粒在细胞中进行表达，纯化，得到重组人胱抑素C蛋白。优选地，在步骤1)中，所述CD33蛋白信号肽的编码基因通过按照人胱抑素C基因成熟肽的序列设计引物克隆获得，上游引物的基因序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的基因序列如SEQ ID NO:4所示。本专利技术的利用哺乳细胞表达载体，通过对引导人胱抑素C蛋白分泌表达信号肽的优化，采用了CD33蛋白的信号肽，使得重组人胱抑素C蛋白在HEK293细胞中的表达达到了23mg/L的表达量，比现有技术中的普通方法提高了7-8倍，克服原核表达系统无法完成翻译后加工与修饰的缺点的基础上，利用哺乳表达系统获得了高产量的重组人胱抑素C蛋白；通过镍柱一步纯化，经SDS-PAGE分析获得了纯度>95％的重组人胱抑素C蛋白，经Sec-HPLC分析，纯度达到99.9％以上。附图说明以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中：图1为哺乳细胞表达载体pcDNATM3.3-TOPO质粒图谱。图2为本专利技术中的纯化后重组人胱抑素C蛋白的SDS-PAGE还原和非还原电泳图，其中R表示还原状态下的电泳结果，NR表示非还原状态下的电泳结果，MK表示蛋白marker。图3为本专利技术中的重组人胱抑素C蛋白的Sec-HPLC色谱图。具体实施方式除非特别指明，以下实施例中所用的试剂和药品均可从正规渠道商购获得。实施例1人胱抑素C蛋白的信号肽优化CD33蛋白具有高分泌天然信号肽序列，本方法采用在线信号肽预测网站SignalP 4.1Server http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/对以CD33蛋白信号肽替换人胱抑素C自身信号肽对人胱抑素C成熟肽的分泌的信号肽切割位点进行预测，结果显示切割位点位于CD33信号肽的丙氨酸16和甲硫氨酸17之间，说明CD33蛋白信号肽可以引导人胱抑素C成熟肽的分泌。实施例2人胱抑素C哺乳表达载体的构建，表达及纯化1.人胱抑素C哺乳表达载体的改造哺乳表达载体pcDNATM3.3-TOPO(Invitrogen)经改造在TOPO克隆位点处引入Kozac序列(SEQ ID NO:5：GCCGCCACC，用来增强真核基因翻译效率)及CD33蛋白信号肽(核苷酸序列:SEQ ID NO：1；氨基酸序列：SEQ ID NO：2)，同时在信号肽之后引入Xho I和EcoR I酶切位点，以便基因的插入，改造后的载体命名为pcDNATM3.3-TOPO-CD33，pcDNATM3.3-TOPO-CD33载体质粒以Xho I和EcoR I双酶切对载体线性化处理，胶回收。2.人胱抑素C哺乳表达载体的构建按照pcDNATM3.3-TOPO-CD33载体及人胱抑素C基因成熟肽的序列设计引物：上游引物：GTGGGCAGGGGCCCTGGCTATGTCCAGTCCCGGCAAGCCGCCG(SEQ ID NO:3)下游引物：CATTACTAACCGGTGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGGCGTCCTGACAGGTGGA(SEQ ID NO:4)。以带有载体同源序列(下划线部分)的上下游引物在55℃退火条件下扩增人胱抑素C编码成熟肽基因片段(79-438bp)，胶回收，使用NovRec seamless cloning试剂盒无缝连接到pcDNATM3.3-TOPO-CD33经双酶切线性化处理后的载体上。转化DH5a,利用菌落PCR进行阳性鉴定，将鉴定为阳性的重组子进行测序鉴定。将测序正确的克隆安排质粒中抽，用于HEK293细胞的转染。3.人胱抑素C在HEK293细胞(购自罗氏公司)中的表达3.1.转染前1天传代密度为0.6×106个/ml或前2天传代密度为0.3×106个/ml；3.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1-1.4×106个/ml，活力>80％时，用于转染；3.3.转染复合物配制：每个项目需备两个/离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置：管中加入600μl PBS/培养基，20μg质粒，混匀，静置5min；管中加入600μl PBS/培养基，80μg聚醚酰亚胺(PEI)(PEI/质粒＝4：1)，混匀，静置5min；3.4.将稀释后的PEI加入至稀释后的质粒中，快速颠倒6-10次，混合均匀，配制成转染复合物(转染复合物配制时动作一定要轻柔迅速，混合均匀，以防止局部DNA-PEI复合物的产生)；3.5.转染复合物静置15-20min后，单滴匀速加入细胞培养物中(边滴加边摇晃细胞培养物)；3.6.于37，8％CO2，130rpm，摇床培养，5天后进行产物收集检测。4.重组人胱抑素C蛋白的纯化4.1样品预处理20ml培养上清加本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人胱抑素C表达载体，包括哺乳动物表达载体和CD33蛋白信号肽的编码基因，所述CD33蛋白信号肽的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种重组人胱抑素C表达载体，包括哺乳动物表达载体和CD33蛋白信号肽的编码基因，所述CD33蛋白信号肽的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组人胱抑素C表达载体，其特征在于，所述哺乳动物表达载体为pcDNATM3.3-TOPO、PTT5或pcDNA4/His A。3.根据权利要求1或2所述的重组人胱抑素C表达载体，其特征在于，所述CD33蛋白信号肽的序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1或2所述的重组人胱抑素C表达载体，其特征在于，所述表达载体中还包括Kozac序列，所述Kozac序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。5.一种转基因细胞，包括权利要求1至4中任一项所述的重组人胱抑素C表达载体。6.根据权利要5所述的转基因细胞，其特征在于，所述细胞为HEK293细胞、NS...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔利兰，刘虹均，由超，丁雨，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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