本发明专利技术公开了大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP‑OA2及其制备方法，所述抗氧化肽AOP‑OA2的氨基酸序列中如序列表中SEQ ID NO：1所示。从大绿臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到，所分离得到的抗氧化多肽AOP‑OA2具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP‑OA2在自由基ABTS+清除实验中显示了较强的抗氧化活性，揭示本发明专利技术大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP‑OA2有潜在的应用前景。大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP‑OA2具有结构简单、抗氧化活性强的有益特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学
，具体是大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2及其制备方法。
技术介绍
抗氧化剂是阻止氧气不良影响的物质，它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。目前已经发现了大量的抗氧化剂，这些抗氧化剂可以被分为以下两大类：1)非基因编码的小分子无助，如维生素E、维生素C、谷胱甘肽等；2)基因编码的大分子物质，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白等。这些抗氧化剂已经被广泛应用于各种领域，包括健康、食品、化妆品及各种工业中，比如作为燃料和润滑剂的稳定剂防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合从而避免引擎积垢形成的目的，单在2007年，工业用途的抗氧化剂的就创造了大约37亿美元的收入。基于抗氧化剂的重要性，科学家们一直在孜孜不倦的寻找着新型抗氧化剂。两栖动物是水生动物过度到陆生动物之间的重要类群，其皮肤裸露，表面没有毛发覆盖，直接面对各种生存压力，承当着诸多重要的生物学功能，比如抵御微生物入侵、体色调节、水盐平衡调节等。已经有大量的研究证据表明，两栖动物的皮肤能分泌大量的活性物质(主要是蛋白和多肽)使得其能完成这些重要的生物学功能。最近，在一些两栖动物(大绿臭蛙、滇蛙等)的皮肤中发现了一类新型的抗氧化剂，其化学本质为多肽，和传统的两大类抗氧化剂不同，其由基因编码，但分子量却很小。和传统的抗氧化剂相比，我们对这一类新型抗氧化剂的结构和功能了解还知之甚少。大绿臭蛙是中国特有的一种臭蛙，广泛分布于强紫外照射的云贵高原，根据其生境，我们推测其皮肤能分泌高效的抗氧化剂使得其能抵御紫外照射所造成的伤害。专利技术人从中国产大绿臭蛙的皮肤中得到了1个新颖的抗氧化多肽AOP-OA2，其抗氧化活性很强，约为维生素E的1000倍。将本专利技术的大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供结构简单、抗氧化活性强的大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2，所述抗氧化肽AOP-OA2的氨基酸序列中如序列表中SEQ ID NO：1所示。本专利技术另一目的是提供大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2的制备方法，从大绿臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到，所分离得到的抗氧化多肽AOP-OA2具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。作为本专利技术进一步的方案：所述大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2的制备方法，具体包括以下步骤：1)用电刺激法取大绿臭蛙皮肤分泌物，并将其溶解于生理盐水，制得混合物，真空冷冻干燥，-80°保存备用；2)超滤：将混合物采用超滤管进行超滤，截留分子量为10KDa；3)高效液相色谱反相层析：将步骤2)所得物质真空冷冻干燥后溶于去离子水，制得样品，将样品上样于预先用含有三氟乙酸的超纯水平衡好的Hypersil ODS2色谱柱中，在流速为1ml/min的条件下，用含三氟乙酸的乙腈在线性梯度条件下进行洗脱即得，监测波长为215nm，线性梯度条件：0-100％in 100min。作为本专利技术进一步的方案：超纯水中三氟乙酸的质量含量为0.1％。作为本专利技术进一步的方案：乙腈中三氟乙酸的质量含量为0.1％。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2在自由基ABTS+清除实验中显示了较强的抗氧化活性，揭示本专利技术大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2有潜在的应用前景。大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2具有结构简单、抗氧化活性强的有益特点。附图说明图1为本专利技术大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2的HPLC反相C18柱层析图。图2为本专利技术分离纯化大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2的自由基ABTS+清除活性图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2，其制备方法可以通过生物化学分离纯化方法，由大绿臭蛙皮肤分泌物中得到。上述方法制备的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2，可通过质谱及抗氧化活性进行鉴定。大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2的制备也可通过本领域常规的方法，采用化学合成或基因表达的方式得到，它们的氨基酸序列与本专利技术SEQ ID NO:1相同。实施例1本专利技术实施例中，大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2分离纯化和鉴定1、分离纯化大绿臭蛙活体采自大绿保山，用电刺激法取其皮肤分泌物(溶解于生理盐水)，真空冷冻干燥，-80°保存备用。第一步：超滤(用millipore超滤管，截留分子量为10KDa)。第二步：高效液相色谱反相层析：第一步所得样品真空冷冻干燥后溶于去离子水后上样于预先用超纯水(含0.1％的三氟乙酸)平衡好的Hypersil ODS2 5mm柱子(伊利特产品，尺寸为4.6mm×300mm)，实验仪器为Waters 1525高压液相系统，在流速为1ml/min的条件下，用乙腈(含0.1％的三氟乙酸)在线性梯度(0-100％in 100min)条件下进行洗脱，监测波长为215nm。AOP-OA2对应HPLC反相C18柱层析图(图1)中的1峰所示。2、分子鉴定氨基酸序列的测定：纯化得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2在全自动蛋白质序列测定仪(岛津PPSQ-31A)上经Edman降解法，测定了大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2氨基酸全序列，结果表明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2具有本专利技术SEQ ID NO:1所示的结构：PhePheProCys LysSer。实施例2大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性本专利技术利用自由基ABTS+清除活性实验检测大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性，结果表明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA2具有较强的抗氧化活性7mM的ABTS在水中和2.8mM的过硫酸钾混合，室温黑暗环境中反应6个小时，使得ABTS被氧化成为ABTS+自由基，之后用去离子水稀释50倍，取50μL稀释液和50μL样品混合，室温黑暗环境下反应30分钟，之后，在415nm波长下测其吸光度。自由基ABTS+的清除率(％)用下述公式进行计算：(Ablank-Asample)×100/Ablank。不同浓度大绿臭蛙抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性如图2所示。对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本专利技术的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本专利技术。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本专利技术的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本专利技术内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领本文档来自技高网...
【技术保护点】
大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP‑OA2，其特征在于，所述抗氧化肽AOP‑OA2的氨基酸序列中如序列表中SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2，其特征在于，所述抗氧化肽AOP-OA2的氨基酸序列中如序列表中SEQ ID NO：1所示。2.大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2的制备方法，其特征在于，从大绿臭蛙皮肤分泌物中分离纯化得到，所分离得到的抗氧化多肽AOP-OA2具有如序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的大绿臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA2的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)用电刺激法取大绿臭蛙皮肤分泌物，并将其溶解于生理盐水，制得混合物，真空冷冻干燥，-80°保存备用；2)超滤：将混合物采用超滤管进行超滤，截留分子...
【专利技术属性】
技术研发人员：何川，
申请(专利权)人：昆明珀凡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53
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