利用毛细管电泳技术对连翘中8种木脂素类成分进行定量测定的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用毛细管电泳技术对连翘中8种木脂素类成分进行定量测定的方法。该方法包括以下步骤：供试样品溶液的制备、对照品溶液的制备、HPCE色谱条件的优化、标准曲线的制定及含量测定。采用本发明专利技术的方法在18min内实现了连翘中8种木脂素类成分的完全基线分离，该方法简便、专属性强、重复性好、分离度好，快捷准确，且不使用有机溶剂，环保高效。本发明专利技术的提出为今后药材连翘的质量评价提供了一种经济、环保、高效的技术手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种对连翘中有效成分进行定量测定的方法，特别涉及一种利用毛细管电泳技术对连翘中8种木脂素类成分进行定量测定的方法，本专利技术属于药材质量评价

技术介绍
连翘为木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，味苦，性微寒，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效，主治温热、丹毒、斑疹、痈疡肿毒、瘰疬、小便淋闭等症。《中国药典》2010和2015年版均以代表性的木脂素类化合物连翘苷为指标成分之一进行质量评价。然而根据中药具有多成分、多靶点的特点，采用多个指标性成分进行中药质量评价已毋容置疑，更具有科学性和全面性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够同时定量检测连翘中8种木脂素类成分的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种利用毛细管电泳技术对连翘中8种木脂素类成分进行定量测定的方法，包括以下步骤:(1)供试样品溶液的制备精密称取连翘果的干燥粉末或连翘提取物的干燥粉末，每克干燥粉末加入20％(v/v)甲醇5ml，超声提取30min，共提取3次，放冷后，用20％(v/v)甲醇调整至15ml，混合物在4℃4000rpm，离心5分钟，上层清液经微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液；(2)对照品溶液的制备精密称取连翘中8种木脂素类成分的对照品，分别用50％(v/v)甲醇配制成不同浓度的对照品溶液；(3)HPCE色谱条件色谱柱：石英毛细管柱；流动相：50mM四硼酸钠、2mMβ-CD以及5％(v/v)甲醇混合得到的电解质缓冲液，采用阳极0.5psi压力进样，时间5s，检测波长234nm，分离电压为+20kV，柱温35℃，在选定实验条件下进行分离，分离进行3-5次后，更换缓冲液；(4)标准曲线的制定及计算结果将不同浓度的8种对照品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，以分析物和内标物峰面积比值为纵坐标，分析物的浓度为横坐标，分别绘制8种木脂素类成分的标准曲线，将供试样品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，将8种分析物与内标物峰面积比值代入标准曲线，分别得到样品中8种木脂素类成分的含量。在本专利技术中，优选的，所述的连翘果或连翘提取物的干燥粉末为100目的干燥粉末。在本专利技术中，优选的，步骤(1)中所述的微孔滤膜的孔隙为0.45μm。在本专利技术中，优选的，步骤(1)中所述的超声提取的频率为70kHz。在本专利技术中，优选的，步骤(3)中所述的石英毛细管柱的规格是48.5cm×50μm，有效长度为40cm。在本专利技术中，优选的，步骤(3)中所述的电解质缓冲液的pH值为10.30。在本专利技术中，优选的，步骤(3)中样品及缓冲液均在4℃储存，在使用前用0.45μm微孔滤膜滤过，且临用前超声脱气处理。在本专利技术中，所述的8种木脂素类成分依次为连翘苷，连翘脂素，表松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，(-)-落叶松树脂醇，(+)松脂素，异落叶松脂素以及vladinol D。本专利技术采用毛细管电泳的方法在18min内实现了连翘中8种木脂素类成分的完全基线分离，该方法简便、快捷准确，且不使用有机溶剂，环保高效，为今后药材连翘的质量评价提供了一种经济、环保、高效的技术手段。附图说明图1为标准品(A)及连翘提取物或药材(B)的HPCE色谱图。注：S1连翘提取物；S5连翘药材；1＝连翘苷,2＝连翘脂素，3＝表松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷,4＝(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷,5＝(-)-落叶松树脂醇,6＝(+)松脂素,7＝异落叶松脂素，8＝vladinol D，IS，异嗪皮啶。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1连翘中8种木脂素类成分的定量测定方法1、仪器与试药Beckman P/ACETM MDQ型毛细管电泳仪(Beckman公司，美国)，配有二极管阵列检测器，石英毛细管柱(48.5cm×50μm，有效长度40cm,Beckman公司)；数据采集和谱图处理采用Beckman System Gold软件(Beckman公司)。连翘药材分别采购于山西和山东，包括老翘和青翘，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。连翘提取物为购买品，其产地为四川。2、分离条件的优化通过优化紫外检测的波长，并对pH值、β-CD、甲醇和硼砂缓冲的浓度进行分析。连翘木脂素的检测波长的选择是利用二极管阵列检测，通过最大峰面积和稳定的基线作为考察指标，选定最优紫外检测波长234nm。最佳色谱图见图1。3、实验方法(1)供试样品溶液的制备精密称取连翘果的干燥粉末或连翘提取物干燥粉末(100目，1g)，加入20％(v/v)甲醇5ml，超声提取(70kHz)30min，共提取3次，放冷后，用20％(v/v)甲醇调整至15ml，混合物在4℃4000rpm，离心5分钟，上层清液经0.45μm孔隙的微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液。(2)对照品溶液的制备精密称取连翘中8种木脂素类成分的对照品，分别用50％(v/v)甲醇配制成不同浓度的对照品溶液。(3)HPCE色谱条件色谱柱：石英毛细管柱(48.5cm×50μm，有效长度为40cm，Beckman公司)；流动相：50mM四硼酸钠、2mMβ-CD以及5％(v/v)甲醇混合得到的电解质缓冲液(pH值10.30)，采用阳极0.5psi压力进样，时间5s，检测波长234nm，分离电压为+20kV，柱温35℃。在选定实验条件下进行分离，分离进行3-5次后，更换缓冲液，样品及缓冲液均在4℃储存，在使用前用0.45μm微孔滤膜滤过，且临用前超声脱气处理。(4)标准曲线的制定及计算结果将不同浓度的8种对照品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，以分析物和内标物峰面积比值为纵坐标，分析物的浓度(μg/mL)为横坐标，绘制8种标准曲线，将供试样品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，将8种分析物与内标物峰面积比值代入标准曲线，分别得到8种成分含量。4、线性回归方程的建立将不同浓度的8种对照品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，以分析物和内标物峰面积比值为纵坐标，分析物的浓度(μg/mL)为横坐标，绘制8种成分标准曲线，见表1。表1线性回归方程注：1＝连翘苷，2＝连翘脂素，3＝表松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，4＝(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷，5＝(-)-落叶松树脂醇，6＝(+)松脂素，7＝异落叶松脂素，8＝vladinol D。5、精密度试验按照步骤(3)的色谱条件连续测定，分别记录8种化合物的保留时间和峰面积，分别记录日内精密度和日间精密度，见表2。表2 8种成分的日间、日内精密度6、稳定性试验按照步骤(3)的色谱条件，每隔2h测定一次，记录24h内保留时间和峰面积值，RSD均小于2.80％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。7、重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用毛细管电泳技术对连翘中8种木脂素类成分进行定量测定的方法，其特征在于包括以下步骤:(1)供试样品溶液的制备精密称取连翘果的干燥粉末或连翘提取物的干燥粉末，每克干燥粉末加入20％(v/v)甲醇5ml，超声提取30min，共提取3次，放冷后，用20％(v/v)甲醇调整至15ml，混合物在4℃4000rpm，离心5分钟，上层清液经微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液；(2)对照品溶液的制备精密称取连翘中8种木脂素类成分的对照品，分别用50％(v/v)甲醇配制成不同浓度的对照品溶液；(3)HPCE色谱条件色谱柱：石英毛细管柱；流动相：50mM四硼酸钠、2mMβ‑CD以及5％(v/v)甲醇混合得到的电解质缓冲液，采用阳极0.5psi压力进样，时间5s，检测波长234nm，分离电压为+20kV，柱温35℃，在选定实验条件下进行分离，分离进行3‑5次后，更换缓冲液；(4)标准曲线的制定及计算结果将不同浓度的8种对照品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，以分析物和内标物峰面积比值为纵坐标，分析物的浓度为横坐标，分别绘制8种木脂素类成分的标准曲线，将供试样品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，将8种分析物与内标物峰面积比值代入标准曲线，分别得到样品中8种木脂素类成分的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种利用毛细管电泳技术对连翘中8种木脂素类成分进行定量测定的方法，其特征在于包括以下步骤:(1)供试样品溶液的制备精密称取连翘果的干燥粉末或连翘提取物的干燥粉末，每克干燥粉末加入20％(v/v)甲醇5ml，超声提取30min，共提取3次，放冷后，用20％(v/v)甲醇调整至15ml，混合物在4℃4000rpm，离心5分钟，上层清液经微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液；(2)对照品溶液的制备精密称取连翘中8种木脂素类成分的对照品，分别用50％(v/v)甲醇配制成不同浓度的对照品溶液；(3)HPCE色谱条件色谱柱：石英毛细管柱；流动相：50mM四硼酸钠、2mMβ-CD以及5％(v/v)甲醇混合得到的电解质缓冲液，采用阳极0.5psi压力进样，时间5s，检测波长234nm，分离电压为+20kV，柱温35℃，在选定实验条件下进行分离，分离进行3-5次后，更换缓冲液；(4)标准曲线的制定及计算结果将不同浓度的8种对照品溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，以分析物和内标物峰面积比值为纵坐标，分析物的浓度为横坐标，分别绘制8种木脂素类成分的标准曲线，将供试样品溶液在步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁军，穆光锐，
申请(专利权)人：黑龙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23