本发明专利技术涉及检测长爪沙鼠感染幽门螺旋杆菌的方法。其包括以下步骤：步骤一：对长爪沙鼠禁食不禁水以排空其胃中的消化物；步骤二：向所述长爪沙鼠的胃中灌生理盐水或水；步骤三：从所述长爪沙鼠的胃中抽取液体；步骤四：以所述液体为样本提取基因组；步骤五：进行巢式PCR：以所述基因组为模板使用第一对引物进行第一轮PCR获得第一PCR产物；以所述第一PCR产物为模板使用第二对引物进行第二轮PCR获得第二PCR产物；步骤六：检测所述第二PCR产物，当检测到所述第二PCR产物的大小与其预期的大小相同，或所述第二PCR产物的序列与其预期的序列相同时，那么确认所述长爪沙鼠感染所述幽门螺旋杆菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测长爪沙鼠感染幽门螺旋杆菌的方法。
技术介绍
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)形态特征与弯曲菌类似，革兰阴性，呈螺形、S型或海鸥展翅状，在胃粘液层中常呈鱼群样排列，传代培养后活在不利环境条件下可变成杆状或球形。菌体一端或两端可有多根鞭毛。幽门螺旋杆菌为微需氧细菌，最适生长温度为35-37℃。营养要求高，需血液或血清，生长时还需要一定湿度。球形变的细菌，通常处于休眠状态，在体外难以传代培养，但在体内环境条件适宜时可转化成螺旋形细菌。此类菌主要以隐性感染形式存在于长爪沙鼠(拉丁文学名：Meriones Unguiculatus；英文名：Mongolian gerbil)的胃窦部，可引起宿主不同程度的病理反应从而导致慢性胃炎、胃溃疡、肠化生甚至胃癌的发生。模型动物感染螺杆菌时，可引起诱发一些并发疾病，严重影响实验动物质量并对实验数据的可靠性产生潜在的干扰。此外幽门螺旋杆菌在人和长爪沙鼠间可以相互传播，携带幽门螺旋杆菌的长爪沙鼠可以通过接触传播给饲养人员和实验人员，造成人员感染。目前，长爪沙鼠幽门螺旋杆菌感染的检测方法主要有病原学、血清学、尿素酶试验及分子生物学方法：(1)细菌分离培养。取胃窦和胃体组织，在特殊的培养基和微氧环境下培养分离该菌。本方法检测需要对动物进行处死取材，成本较高实验周期长，需要培养3-6d，生化鉴定试验操作繁琐，耗时费力。虽然培养出细菌后可以确诊，但其假阴性率较高。(2)血清学检测。运用ELISA方法来检测血清或粪便中抗幽门螺旋杆菌特异性抗体。免疫学方法操作简便，可在同一时间内检测大量样品，但长爪沙鼠作为一种正在实验动物化的动物，没有很好的抗体适用于ELISA检测。(3)PCR检测。直接检测粪便、肠内容物及胃组织中该菌体的DNA。但该方法大多需要将动物处死后取动物组织、肠内容物以及活体检测粪便。由于 长爪沙鼠主要生活在荒漠地带，所以其粪便含水量较低，不利于细菌生存，故粪便检测幽门螺旋杆菌的假阴性率也比较高。长爪沙鼠是实验动物中使用非常广泛及数量颇多的动物，据文献报道，长爪沙鼠是作为幽门螺旋杆菌致病性研究的重要实验动物，在幽门螺旋杆菌感染的条件下，长爪沙鼠会出现胃炎、胃溃疡、肠化生甚至出现胃癌。幽门螺旋杆菌的感染可对饲养人员和实验人员造成伤害并且可对实验数据的可靠性产生严重的干扰。基于目前的各种检测方法，还需要一种操作相对简易、结果可靠且成本低廉的检测实验长爪沙鼠活体感染幽门螺旋杆菌的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测更容易、更可靠且成本低廉的实验长爪沙鼠活体感染幽门螺旋杆菌的方法。因此，本专利技术提供了一种检测长爪沙鼠(拉丁文学名：Meriones Unguiculatus；英文名：Mongolian gerbil)感染幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的方法，其包括以下步骤：步骤一：对所述长爪沙鼠禁食不禁水以排空其胃中的消化物；步骤二：向所述长爪沙鼠的胃中灌生理盐水或水；步骤三：从所述长爪沙鼠的胃中抽取液体；步骤四：以所述液体为样本提取基因组；步骤五：进行巢式PCR：以所述基因组为模板使用第一对引物进行第一轮PCR获得第一PCR产物；以所述第一PCR产物为模板使用第二对引物进行第二轮PCR获得第二PCR产物；步骤六：检测所述第二PCR产物，当检测到所述第二PCR产物的大小与其预期的大小相同，或所述第二PCR产物的序列与其预期的序列相同时，那么确认所述长爪沙鼠感染所述幽门螺旋杆菌。在设计本专利技术的巢式PCR的扩增的片段时，一般来讲，第一PCR产物的大小为300-800bp，优选为400-600bp；第二PCR产物的大小为80-150bp，优选为80-120bp。在本专利技术中，所述第一对引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述第二对引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。在本专利技术中，所述长爪沙鼠禁食不禁水的时间为18-36小时，优选为20-28小时。在本专利技术中，在所述步骤二中，使用灌胃针向所述长爪沙鼠的胃中灌所述生理盐水或水0.3-0.6ml。在本专利技术中，在所述步骤三中，抽取液体的体积70-120μL。在本专利技术中，在第一轮PCR的反应程序如下：92-98℃预变性0-10min；92-98℃变性0.5-2min、40-55℃退火0.5-2min、65-78℃延伸0.5-2min，循环20-45次；65-78℃终延伸0-15min；优选第一轮PCR的反应程序如下：94-96℃预变性2-5min；94-96℃变性0.5-1min、42-47℃退火0.5-1min、70-73℃延伸0.5-1min，循环25-35次；70-73℃终延伸2-10min。在本专利技术中，在第二轮PCR的反应程序如下：92-98℃预变性0-7min；92-98℃变性15-60sec、43-58℃退火15-60sec、65-78℃延伸15-60sec，循环20-45次；65-78℃终延伸0-15min；优选第二轮PCR的反应程序如下：94-96℃预变性30-180sec；94-96℃变性20-40sec、46-51℃退火20-40sec、72℃延伸20-40sec，循环25-35次；70-73℃终延伸1-5min。在本专利技术中，第一轮PCR的体系中各组分的比例关系如下：模板：SEQ ID No.1：SEQ ID No.2：10倍的的PCR缓冲液：DNA聚合酶：水＝10-100ng：0.5-1.5μmol：0.5-1.5μmol：4-6μL：0.5-3U：32-48μL；优选模板：SEQ ID No.1：SEQ ID No.2：10倍的PCR缓冲液：DNA聚合酶：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：4-6μL：0.5-1U：38-42μL；更优选模板：SEQ ID No.1：SEQ ID No.2：2×PCR Master Mix或2×PreMix rTaq：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：23-28μL：17-25μL。其中2×PCR Master Mix购自Thermo公司；2×PreMix rTaq购自Thermo公司。并且2×PCR Master Mix或2×PreMix rTaq中的组分以说明书中为准。在本专利技术中，在第二轮PCR的体系中各组分的比例关系如下：模板：SEQ ID No.3：SEQ ID No.4：10倍的的PCR缓冲液：DNA聚合酶：水＝10-100ng：0.5-1.5μmol：0.5-1.5μmol：4-6μL：0.5-3U：32-48μL；优选模板：SEQ ID No.3：SEQ ID No.4：10倍的PCR缓冲液：DNA聚合酶：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：4-6μL：0.5-1U：38-42μL；更优选模板：SEQ ID No.3：SEQ ID No.4：2×PCR Master Mix或2×PreMix rTaq：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：23-28μL：17-25μL。其中2×PCR Master Mix购自Thermo公司；2×PreMix rTaq购自Thermo公司。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测长爪沙鼠(Meriones Unguiculatus)感染幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的方法，其包括以下步骤：步骤一：对所述长爪沙鼠禁食不禁水以排空其胃中的消化物；步骤二：向所述长爪沙鼠的胃中灌生理盐水或水；步骤三：从所述长爪沙鼠的胃中抽取液体；步骤四：以所述液体为样本提取基因组；步骤五：进行巢式PCR：以所述基因组为模板使用第一对引物进行第一轮PCR获得第一PCR产物；以所述第一PCR产物为模板使用第二对引物进行第二轮PCR获得第二PCR产物；步骤六：检测所述第二PCR产物，当检测到所述第二PCR产物的大小与其预期的大小相同，或所述第二PCR产物的序列与其预期的序列相同时，那么确认所述长爪沙鼠感染所述幽门螺旋杆菌。
【技术特征摘要】
1.一种检测长爪沙鼠(Meriones Unguiculatus)感染幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的方法，其包括以下步骤：步骤一：对所述长爪沙鼠禁食不禁水以排空其胃中的消化物；步骤二：向所述长爪沙鼠的胃中灌生理盐水或水；步骤三：从所述长爪沙鼠的胃中抽取液体；步骤四：以所述液体为样本提取基因组；步骤五：进行巢式PCR：以所述基因组为模板使用第一对引物进行第一轮PCR获得第一PCR产物；以所述第一PCR产物为模板使用第二对引物进行第二轮PCR获得第二PCR产物；步骤六：检测所述第二PCR产物，当检测到所述第二PCR产物的大小与其预期的大小相同，或所述第二PCR产物的序列与其预期的序列相同时，那么确认所述长爪沙鼠感染所述幽门螺旋杆菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一对引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述第二对引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述长爪沙鼠禁食不禁水的时间为18-36小时，优选为20-28小时。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，使用灌胃针向所述长爪沙鼠的胃中灌所述生理盐水或水0.3-0.6ml。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤三中，抽取液体的体积70-120μL。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，在第一轮PCR的反应程序如下：92-98℃预变性0-10min；92-98℃变性0.5-2min、40-55℃退火0.5-2min、65-78℃延伸0.5-2min，循环20-45次；65-78℃终延伸0-15min；优选第一轮PCR的反应程序如下：94-96℃预变性2-5min；94-96℃变性0.5-1min、42-47℃退火0.5-1min、70-73℃延伸0.5-1min，循环25-35次；70-73℃终延伸2-10min。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，在第二轮PCR的反应程序如下：92-98℃预变性0-7min；92-98℃变性15-60sec、43-58℃退火15-60sec、6...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈振文，李长龙，王存龙，杜小燕，郭萌，刘欣，路静，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。