本发明专利技术涉及一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C‑端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr‑Met‑Leu‑Asp‑Leu‑Gln‑Pro‑Glu‑Thr‑Gly‑Gly‑Gly，并且所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。本发明专利技术还提供了一种诱导产生识别HPV的DC细胞的方法。通过本发明专利技术的试剂盒和方法，可有效地将从患者的外周血或骨髓分离的单核细胞诱导成识别HPV的DC细胞，用于后续的细胞免疫治疗或用于科研用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗HPV领域，更特别地，涉及一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，以及诱导方法。
技术介绍
宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生命。我国是宫颈癌高发国家,特别是近年来年轻宫颈癌患者有明显上升趋势，发病率以每年2％-3％速度增长。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)可引起良、恶性增生，特别是高危型HPV与宫颈癌的关系密切。目前，对宫颈癌的治疗多采用手术、化疗、放疗、生物治疗和中医疗法联合应用。这些疗法的共同缺陷是缺乏特异，对正常组织细胞损伤大,毒副作用大，不但疗效不能满意，而且医疗费用巨大。随着免疫识别理论、分子生物学知识和电子显微技术的不断进展与突破,大量研究证实发现T细胞对于抗原的识别是与MHC分子结合递呈的抗原短肽。即当外源性抗原被抗原呈递细胞捕获后，蛋白质抗原在内吞系统被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T细胞表位与MHC I类分子结合，被转运至APC表面供T细胞受体识别，从而激发细胞免疫应答，发挥免疫调节作用。通过结合这些免疫理论，研究者和医疗人员联想到可通过体外致敏活化树突状细胞，活化的树突状细胞会输至患者体内，从而诱导特异性的CTL，攻击病原体以及受感染的细胞。在不断实践的基础上，他们研发出主动的、特异的细胞免疫治疗。细胞免疫治疗特异性地杀伤受感染的细胞，对正常细 胞和组织伤害较小，并且对机体免疫起巨大的促进作用，所以一经出现就吸引了医学界的目光。然而，该治疗方法仍然处于研发阶段，许多问题亟待解决。对于HPV感染的细胞免疫治疗而言，有效诱导出能够特异性识别HPV的DC细胞就是难题之一。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，其包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly并且所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。优选地，所述试剂盒还可包含GM-CSF和IL-4。优选地，所述试剂盒还可包含CD14微珠。本专利技术还提供了一种诱导产生识别HPV的DC细胞的方法，包括以下步骤：1)从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)得到的所述CD14+细胞，使所述CD14+细胞分化成成熟的DC细胞；3)使用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒中的树状多肽冲击步骤2)得到的成熟的DC细胞，即得到识别HPV的DC细胞。优选地，通过白细胞分离法从外周血或骨髓分离所述单核细胞。优选地，在步骤3)之前对步骤2)得到的细胞进行DC细胞的分子标记染色，以确认所述CD14+细胞已经分化成成熟的DC细胞。优选地，所方法包括以下步骤：1)通过白细胞分离法从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；2)将步骤1)中得到的CD14+细胞重悬于含有50ng/ml IL-4和100ng/mlGM-CSF的RPMI-1640培养基中，使所述CD14+细胞分化成DC细胞，在培养过程中取样，并对所述样品进行分子标记CD86、CD40、CD80、HLA-DR和MHC-I染色，当所述分子标记都呈阳性时，将所述DC细胞用于下一步；3)使用所述树状多肽冲击步骤2)得到的所述DC细胞，所得到的DC细胞即为识别HPV的DC细胞。通过本专利技术的试剂盒和方法，可有效地将从患者的外周血或骨髓分离的单核细胞诱导成识别HPV的DC细胞，用于后续的细胞免疫治疗或用于科研用途。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1试剂盒的组成本专利技术的用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒包含以下成分：1)树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：2)GM-CSF；3)IL-4；4)CD14微珠。所述树状多肽通过以下方法制备：1.表位肽的预测和筛选1)人乳头瘤病毒抗原及其同源性分析从Genebank中选择HPV16E7蛋白，其98个氨基酸序列：MHGDT PTLHE YMLDT QPETT DLYCY EQLND SSEEE DEIDG PAGQA EPDRA HYNIV TFCCK CDSTL RPLCVQ STHVD IRTLE DLLMG TLGIV CPICS QKP，将E7蛋白氨基酸序列与NCBI数据库中的蛋白片段进行Blast,以确定该段蛋白质的特异性。2)HPV16E7抗原的一般特性预测应用软件CLC Protein Workbench3版本和Signal P3.0软件对蛋白质进行预测，包括疏水性、亲水性、抗原性、跨膜结构域、等电点及信号肽潜在切割位点。本专利技术采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HPV16E7编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测。3)利用SYFPEITHI数据库进行CTL表位初步预测，通过PREDEPP数据库进行MHCI类结合基序预测。4)基序法(1)不同的MHCI类对所结合的肽的组成有不同的要求，但其中起主要作用进而对肽链与MHCI类分子的结合有重要影响的是肽链的两个主要锚点残基，他们在多肽与MHCI类分子的高亲和力结合中是必需的。(2)二级锚点残基的作用除了两个主要锚点残基的必需因素外，多肽链中的其他氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的高或中等亲和力结合也有不可忽视的影响。在其他位置上，不同氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的结合有着不同的影响，有的氨基酸残基有利于结合，而有的则不利于结合。理想的与HLA-A2结合的CTL表位(即有高的或中等亲和力)应不包含不利于结合的氨基酸残基，或有利于结合的残基多于不利于结合的残基。5)多项式方案预测表位肽多项式方案是指当某残基R出现在某肽的第I位时，不考虑其他肽序列的情况下，该残基对于整个肽与MHCI类分子的结合自由能提供了一常量Ri，用在第I位为残基R的大量多肽的IC50的负log10值的平均值来估计此常量。IC50被定义为待测肽将对照肽-MHC复合物中50％的对照肽置换下来的浓度。将其所有氨基酸残基对应的Ri值相加，选择分值大于选定阈值的抗原肽为可能的后选肽。将SYFPEITHI数据库的预测结果和PREDEPP数据库的预测结果进行对比，筛选出作为T细胞表位肽的可能性最大的5条肽:TLHEYMLDL(E7 7-15)、YMLDLQPET(E7 11-19)、RAHYNIVTF(E7 49-57)、RLCVQSTHV(E7 66-74)、LIMGTLGIV(E7 82-90)，再计算其多项式的值，设定阈值，最终筛选出HLA-A2限制性CTL表位肽：YMLDLQPET(E7 11-19)2.表位肽的合成1)运用Fmoc法固相合成优势表位肽其氨基酸序列为：YMLDLQPET(E7 11-19)(1)第一个氨基酸与树脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，其特征在于，包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C‑端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr‑Met‑Leu‑Asp‑Leu‑Gln‑Pro‑Glu‑Thr‑Gly‑Gly‑Gly，并且所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。
【技术特征摘要】
1.一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，其特征在于，包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly，并且所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含GM-CSF和IL-4。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含CD14微珠。4.一种诱导产生识别HPV的DC细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)得到的所述CD14+细胞，使所述CD14+细胞分化成成熟的DC细胞；3)使用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒中的树状多肽冲击步骤2...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗进，闫小君，
申请(专利权)人：江苏安泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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