辣椒高效遗传转化及植株再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种辣椒Flamingo bill外植体介导的遗传转化及植株再生的方法，本发明专利技术通过改良培养基、侵染方式、外植体切割方式、延迟筛选和改进生根方式，在农杆菌的介导下，转化Flamingo bill外植体，经Flamingo bill外植体伤口处愈伤组织的诱导、分化和植株再生等途径，获得可持续生长的遗传转化再生植株，并有效提高辣椒的遗传转化率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物细胞工程
，涉及到植物的遗传转化和植株再生，具体为一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法。
技术介绍
辣椒是一种重要的蔬菜和工业原料作物，遗传转化体系的建立是其基因工程遗传改良和功能基因组学研究的重要基础，而要进行辣椒的遗传转化，建立高效离体再生系统是重要条件之一。目前辣椒的遗传转化体系和离体再生系统还不完善，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。目前植物的植株再生主要通过幼苗外植体器官再生、花药培养和原生质体培养三条途径，其中通过原生质体培养来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。对于辣椒的植株再生，一般通过外植体直接分化成苗、脱分化形成愈伤组织并再分化成苗、Flamingo bill成苗三种方式进行。其中，以幼苗子叶、茎尖和胚轴为外植体的植株再生，是目前在建立辣椒离体再生系统中，研究的最多的一个领域，具体为，利用子叶、茎尖、胚轴等作为外植体经脱分化形成愈伤组织，通过农杆菌的介导将目的基因引入辣椒受体，再通过辣椒体细胞发生途径获得再生植株。但是目前这些辣椒植株再生技术还停留在芽诱导阶段，而对于芽的伸长、生根困难的问题长期难以解决，因而辣椒的遗传转化和离体再生难以真正实现并应用，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。在辣椒的离体再生体系中，Flamingo bill外植体是一种将幼苗去掉茎尖和一片子叶的特殊的外植体，由单片子叶、下胚轴、胚根组成，其切口部位为顶端分生组织所在区域，细胞生长速度快，分化能力强，另外Flamingo bill外植体不同于一般外植体，其具有完整植株的特性，在组织培养中其根系能够吸收营养物质供应顶部分生组织的生长和分化，而一般的外植体在培养中只是靠细胞膨大所引起的被动吸收。然而经过反复试验得知，Flamingo bill外植体介导的辣椒植株再生依然存在很多的缺点：（1）同样受芽伸长困难的限制；（2）从flamingo bill外植体上切下的小苗生根困难；（3）Flamingo bill外植体在固体MS培养基中转移容易导致根部死亡；（3）农杆菌介导的遗传转化在筛选的的过程中容易使Flamingo bill的母体植株死亡；（4）根系易出现带菌污染而致死亡。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术公开一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法， 通过Flamingo bill外植体介导辣椒植株再生，该方法能够有效提高遗传转化率，使不定芽顺利伸长并生根，获得完整辣椒再生植株。本专利技术所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：（1）载体构建：设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体；（2）转化农杆菌及扩繁备用：将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用；（3）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，把辣椒种子培养于MS固体培养基中，25～28℃，1600～2200 Lux光照下培养10～15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，采用Flamingo bill外植体，可大大缩短辣椒遗传转化及植株再生的周期，将制得的Flamingo bill外植体置于液体的MS培养基中，将液体的MS培养基PH调节为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下下预培养1～2天；（4）侵染转化及共培养：取吸光度OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，取出预培养好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，且所述侵染液只没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染20～30min，期间间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，所述共培养基为液体MS基本培养基，预先将共培养基的PH调节为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，在23℃黑暗条件下共培养3～4天；（5）愈伤诱导、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞液洗菌，去除LBA4404农杆菌，并将共培养后的Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，且MS固体培养基PH为5.7～6.2，转移至MS固体培养基后，只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长，期间只需要2～3周即可诱导新生苗的形成并伸长，与传统组培方式相比时间大大缩短；（6）新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织，并转移至生根培养基；（7）生根及筛选：新生植株的生根采用生根培养法或嫁接法，其中，所述生根培养法即在基本MS固体培养基中添加0.5mg/L的NAA（萘乙酸），克服生根困难，获得完整植株，并且添加Basta（除草剂）作为筛选物，调节培养基的PH为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中后，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养12～16天并筛选即可获得完整再生植株；所述嫁接法具体操作步骤如下：a.选取成苗10～14天，生长健壮笔直的无菌辣椒植株作为嫁接母体备用；b.选取Flamingo bill外植体上切下的已有茎尖、主茎及叶片的分化丛芽，切去多余叶片备用；c.准备好含MS固体培养基的平皿及刚溶解好的添加有2倍琼脂粉的MS备用；d.在无菌环境下，用无菌手术刀片将嫁接母体和分化丛芽的伤口切平整垂直，确保嫁接母体和分化丛芽在嫁接时伤口完全接触并保证后期长成一体后植株形态是直立的，然后将两者以伤口完全接触且半镶嵌于平皿中的MS固体培养基中，保持植株形态学上下端呈直线状态，使用2倍琼脂粉的MS培养基，进一步固定；e.将平皿进行密封，保持直立的形态学方式培养于25～28℃垂直光照的环境下，每天14h光照，10h黑暗，每两天观察一次，确认伤口紧密连接并保持鲜活，如果伤口褐化则应取出切去褐化部分，重新嫁接，如遇芽或胚轴伸长使伤口错位，则取出重新调整固定连接，连续培养7～10天后，即可嫁接成功，嫁接成功的幼苗可直接移栽。目前，关于辣椒幼苗外植体再生及Flamingo bill技术还停留在芽诱导部分，没有涉及芽的伸长、生根等辣椒植株再生的完整过程，使得培养的辣椒再生植株难以存活并继续生长发育，难以应用于农业生产和基因工程遗传改良及功能基因组学的研究。申请人经分析认为，目前辣椒幼苗外植体再生及Flamingo bill技术之所以还停留在芽诱导阶段，主要本文档来自技高网...

【技术保护点】
辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）载体构建：设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体；（2）转化农杆菌及扩繁备用：利用表达载体转化农杆菌，并扩繁备用；（3）制备Flamingo bill外植体并进行预培养；（4）侵染转化及共培养：取农杆菌于平皿中，把MS液体培养基进行稀释，并加入乙酰丁香酮后与平皿中的农杆菌混合，得到侵染液，取出预培养好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，且所述侵染液只没过外植体子叶及伤口部分，侵染20～30min，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍加晾干水分即将其转至共培养基，所述共培养基为无菌的液体MS基本培养基，Flamingo bill外植体在黑暗条件下共培养3～4天；（5）愈伤诱导、新茎尖形成及伸长：共培养结束后洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，且只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；（6）新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织；（7）生根及筛选：新生植株的生根采用生根培养法或嫁接法，其中，所述生根培养法即在基本MS固体培养基中添加NAA，并且添加Basta作为筛选物，调节培养基的PH后灭菌，即得生根培养基，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中，培养12～16天并筛选即可获得完整的再生植株。...

【技术特征摘要】
1.辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）载体构建：设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体；（2）转化农杆菌及扩繁备用：利用表达载体转化农杆菌，并扩繁备用；（3）制备Flamingo bill外植体并进行预培养；（4）侵染转化及共培养：取农杆菌于平皿中，把MS液体培养基进行稀释，并加入乙酰丁香酮后与平皿中的农杆菌混合，得到侵染液，取出预培养好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，且所述侵染液只没过外植体子叶及伤口部分，侵染20～30min，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍加晾干水分即将其转至共培养基，所述共培养基为无菌的液体MS基本培养基，Flamingo bill外植体在黑暗条件下共培养3～4天；（5）愈伤诱导、新茎尖形成及伸长：共培养结束后洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，且只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；（6）新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织；（7）生根及筛选：新生植株的生根采用生根培养法或嫁接法，其中，所述生根培养法即在基本MS固体培养基中添加NAA，并且添加Basta作为筛选物，调节培养基的PH后灭菌，即得生根培养基，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中，培养12～16天并筛选即可获得完整的再生植株。2.根据权利要求1所述的辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，其特征在于，在步骤（7）中所述嫁接法的具体工艺步骤如下：a.选取成苗10～14天，生长健壮笔直的无菌辣椒植株作为嫁接母体备用；b.选取Flamingo bill外植体上...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂术君，覃成，黄丽，潘超，李辉，龚敏，史鉴，何伟强，黄洪，张志明，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51