本发明专利技术针对当前泰山黄精生产中用种子繁殖困难，常规根茎繁殖易出现病虫害加重和种质退化，而组培主要以根茎顶芽和茎尖为外植体建立快繁体系，外植体来源单一、试验材料消耗量大、繁殖效率低的现状，选择以比较易得的黄精顶芽芽鳞为外植体试材，通过诱导芽鳞分化获得不定根，再对不定根进一步诱导产生同时具有不定根和顶芽的根茎、不定芽团和多种形态的愈伤组织等不同类型的分化体；对这些类型的分化体分别继续培养，均可继续产生新的不定芽团、具顶芽根茎和多种类型愈伤组织，从而建立泰山黄精离体根、茎、叶的高频再生体系；采用同样的培养基也可获得根茎的高频再生体系。利用以上方法获得的根、茎、叶、愈伤组织及根茎之间在不同培养时期可相互转化生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体为一种利用泰山黄精离体芽鳞为外植体建立泰山黄精高频再生体系的方法及培养基。
技术介绍
泰山黄精(polygonatum sibiricum Red.)为百合科黄精属多年生草本植物，别名老虎姜、鸡头参、仙人余粮等。该属植物约有40多种，主要分布在北温带和北亚热带，我国有31种，全国大部分省市均有分布。泰山黄精与滇黄精、多花黄精同被《中国药典》（2010版）确定为正品药用品种，主要以其肉质根状茎入药，药性甘，平；归脾、肺、肾经；具补气养阴，健脾，润肺，益肾的药用功效。泰山黄精也称“鸡头黄精”，主产泰山地区，是著名的泰山四大名药之一，属药用正品黄精。自古以来，泰山黄精主要作为常用中药方的配药使用，市场需求量并不大，多以采挖野生资源为主。随着对黄精应用研究的不断深入，其用途也日益广泛，除药用保健外，还用以加工成饮料、化妆品及各种菜肴；因其独特的外形，还被作为观赏花卉等园林用途，因此，近年来，市场对黄精的需求量快速增长，供需矛盾日益突出。因目前市场上黄精的来源还主要靠采挖野生资源，这导致了人们对野生资源的过度掠夺性采挖，致使黄精野生资源濒临灭绝，而黄精人工繁育栽植的规模较小，并且面临繁育技术方面的一些问题，如黄精直接用种子繁殖较难且容易出现品种退化问题；生产上一般采用的根茎繁殖方式也存在连续种植后根茎病虫害逐年加重、品质下降的问题，进而影响黄精产品质量和产量。再加上，黄精野生生长环境遭到严重破坏，很难恢复自然种群生长，也更进一步影响了黄精资源的可持续利用和深入发展。为解决黄精供需矛盾，从种源方面改善黄精品质，提高生产繁殖效率，更好地保护生态环境，亟需进行野生黄精人工繁育技术方面的研究。利用组织培养技术对黄精进行快速繁殖，既有利于对黄精野生资源的保护及高效繁殖又有利于黄精药材的商品化生产。对不同品种黄精进行组织培养技术的研究已有很多报道，但大多集中在多花黄精和鸡头黄精。Zhao等以多花黄精顶芽为外植体建立快繁体系，获得黄精再生植株；徐忠传等筛选出有利于离体多花黄精不定芽增殖的最佳6-BA浓度，并得到可用于生根的再生苗，完善了多花黄精组培技术体系；刘红美等以多花黄精带芽根茎为外植体建立多花黄精组织培养快速繁殖体系；万学峰等以多花黄精的根茎为外植体，初步研究了福建多花黄精快速繁殖技术体系，繁殖系数3.0左右；梁引库进行了黄精脱毒苗繁殖方面的现状阐述，指出黄精脱毒组培苗可有效减轻黄精苗木病虫害发生；李莺等以鸡头黄精的根状茎作为外植体，研究了植物激素对其离体快速繁技术的影响。对泰山黄精的组培快繁技术研究，最早报道的是牟小翎等以泰山野生黄精的根状茎顶芽和茎尖为外植体进行培养，获得黄精组培苗，繁殖系数最高可达4.5左右。以上关于黄精组织培养的研究虽然都取得了成功，但都局限于以黄精的地下根茎为外植体建立快繁体系，而根茎外植体因长期深埋在泥土中，容易携带各类病菌，不利于彻底消毒，易导致较高的外植体污染率和较低的无菌体建成率；而用根茎顶芽、茎尖做外植体，虽然提高了无菌体成功率，却存在组培材料来源单一，茎尖剥取的无菌操作不好控制，且需大量消耗根茎顶芽，导致无顶芽的黄精根茎当年难以发芽生长的问题。因此，从目前黄精组培的研究现状来看，黄精的组织培养技术研究还存在一定局限性，对黄精不同器官的组培技术探索也很少，黄精组织培养还存在一定的技术空白。
技术实现思路
本专利技术针对当前泰山黄精生产中用种子繁殖困难，常规根茎繁殖易出现病虫害加重和种质退化，而组培主要以根茎顶芽和茎尖为外植体建立快繁体系，外植体来源单一、试验材料消耗量大、繁殖效率低的现状，选择以比较易得的黄精顶芽芽鳞为外植体试材，通过诱导芽鳞分化获得不定根，再对不定根进一步诱导产生同时具有不定根和顶芽的根茎、不定芽团和多种形态的愈伤组织等不同类型的分化体；对这些类型的分化体分别继续培养，均可继续产生新的不定芽团、具顶芽根茎和多种类型愈伤组织，从而建立泰山黄精离体根、茎、叶的高频再生体系；采用同样的培养基也可获得根茎的高频再生体系。利用以上方法获得的根、茎、叶、愈伤组织及根茎之间在不同培养时期可相互转化生长。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，包含有如下步骤：（1）外植体的选择 选择泰山黄精根茎顶芽外层包被的芽鳞作为外植体；（2）无菌外植体的筛选 将外植体用无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒，消毒完后，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基上，每瓶1片，放置在无菌室暗培养；培养3-9 d后挑选并弃除真菌或细菌污染的外植体，将获得的无菌外植体作为试验材料在诱导分化培养基中继续培养；从第7 d开始，外植体开始出现明显生长变化；（3）外植体再生分化诱导 外植体在诱导分化培养基上培养14 d后，芽鳞基部开始长出白色不定根，随着培养时间延长，不定根表面覆盖白色绒毛，20-30 d后，新生的白色不定根变成条状、片状或束状，并不断伸长至2-4 cm；（4）离体根茎叶的再生诱导A、离体根诱导 将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化启动培养基上，继续培养20-30 d后，在根束基部、距新根的根尖生长点1-1.5 cm处均开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化培养基上培养，继续培养30 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15-23个不同类型的不定芽苗；不定芽苗的类型主要有以下几种：a具有根和顶芽的圆球状根茎；b无根的白色不定芽；c无根，具黄绿色茎叶的小苗；B、离体叶诱导 从不定根诱导获得的不定芽芽团上，选择生长健壮、绿色、叶片宽度大于0.3 cm的完整叶片，单独剪下平铺在分化启动培养基表面，7 d后叶片开始膨大卷翘，14 d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽；平均每片叶的繁殖系数可达6-15；C、离体茎诱导 剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中高度0.5 cm以上、至少具有1个节的茎段，直接插入或平铺在分化启动培养基上，14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段约可产生9-20个不定芽，25 d后逐渐长成直径1-3 cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5-1 cm的小芽团进行继代增殖培养；（5）增殖继代培养将上一步骤中分化的各种器官类型离体根茎叶诱导产生的不定芽和各种类型的分化体在分化继代培养基上进行继代增殖培养，每隔15-20 d继代一次，最后得到泰山黄精高频再生体系。各类型的最高增殖频率可达13，综合增殖效率较仅用根茎繁殖提高2-3倍。所述步骤1中外植体的具体选择方法为：选择生长健壮、无病虫害、性状表现优良的泰山黄精单株为试验株，于10月底11月初地上部分完全枯萎后挖出地下根茎，选择其中具饱满顶芽的根茎为试验材料，或于翌年3月早春挖出地下根茎进行适当催芽，并以此为试验材料进行预处理；选择已初步催芽的生长健壮具饱满顶芽的泰山黄精根茎，先将根茎在流水下冲洗干净表面泥土，去掉多余须根，并用毛刷刷洗残存在根茎表面凹缝中的泥土，再用洗洁精溶液浸泡15 min，然后用流水洗净表面的溶液，再用酒精棉球擦洗表面，直接剥取或待顶芽开始膨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于包含有如下步骤：（1）外植体的选择 选择泰山黄精根茎顶芽外层包被的芽鳞作为外植体；（2）无菌外植体的筛选 将外植体用无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒，消毒完后，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基上，每瓶1片，放置在无菌室暗培养；培养3‑9 d后挑选并弃除真菌或细菌污染的外植体，将获得的无菌外植体作为试验材料在诱导分化培养基中继续培养；从第7 d开始，外植体开始出现明显生长变化；（3）外植体再生分化诱导 外植体在诱导分化培养基上培养14 d后，芽鳞基部开始长出白色不定根，随着培养时间延长，不定根表面覆盖白色绒毛，20‑30 d后，新生的白色不定根变成条状、片状或束状，并不断伸长至2‑4 cm；（4）离体根茎叶的再生诱导A、离体根诱导 将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化启动培养基上，继续培养20‑30 d后，在根束基部、距新根的根尖生长点1‑1.5 cm处均开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化培养基上培养，继续培养30 d后，这些不定芽形成直径2‑3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15‑23个不同类型的不定芽苗；不定芽苗的类型主要有以下几种：a具有根和顶芽的圆球状根茎；b无根的白色不定芽；c无根，具黄绿色茎叶的小苗；B、离体叶诱导 从不定根诱导获得的不定芽芽团上，选择生长健壮、绿色、叶片宽度大于0.3 cm的完整叶片，单独剪下平铺在分化启动培养基表面，7 d后叶片开始膨大卷翘，14 d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽；C、离体茎诱导 剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中高度0.5 cm以上、至少具有1个节的茎段，直接插入或平铺在分化启动培养基上，14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段约可产生9‑ 20个不定芽，25 d后逐渐长成直径1‑3 cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5‑1 cm的小芽团进行继代增殖培养；（5）增殖继代培养将上一步骤中分化的各种器官类型离体根茎叶诱导产生的不定芽和各种类型的分化体在分化继代培养基上进行继代增殖培养，每隔15‑20 d继代一次，最后得到泰山黄精高频再生体系。...
【技术特征摘要】
1.一种建立泰山黄精高频再生体系的方法，其特征在于包含有如下步骤：（1）外植体的选择 选择泰山黄精根茎顶芽外层包被的芽鳞作为外植体；（2）无菌外植体的筛选 将外植体用无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面多余水分，置于无菌空瓶内，在无菌室超净工作台上进行表面消毒，消毒完后，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干表面多余水分，接种于诱导分化培养基上，每瓶1片，放置在无菌室暗培养；培养3-9 d后挑选并弃除真菌或细菌污染的外植体，将获得的无菌外植体作为试验材料在诱导分化培养基中继续培养；从第7 d开始，外植体开始出现明显生长变化；（3）外植体再生分化诱导 外植体在诱导分化培养基上培养14 d后，芽鳞基部开始长出白色不定根，随着培养时间延长，不定根表面覆盖白色绒毛，20-30 d后，新生的白色不定根变成条状、片状或束状，并不断伸长至2-4 cm；（4）离体根茎叶的再生诱导A、离体根诱导 将外植体诱导分化产生的不定根切下，接种在分化启动培养基上，继续培养20-30 d后，在根束基部、距新根的根尖生长点1-1.5 cm处均开始长出浅黄色半透明状颗粒突起，并逐渐长成白色不定芽，将这些不定芽与根束共同体继续在分化培养基上培养，继续培养30 d后，这些不定芽形成直径2-3 cm的不定芽芽团，每个不定芽芽团约有15-23个不同类型的不定芽苗；不定芽苗的类型主要有以下几种：a具有根和顶芽的圆球状根茎；b无根的白色不定芽；c无根，具黄绿色茎叶的小苗；B、离体叶诱导 从不定根诱导获得的不定芽芽团上，选择生长健壮、绿色、叶片宽度大于0.3 cm的完整叶片，单独剪下平铺在分化启动培养基表面，7 d后叶片开始膨大卷翘，14 d后，在叶片基部长出白色颗粒状愈伤或直接长出白色不定芽；C、离体茎诱导 剪取不定根诱导获得的不定芽芽团中高度0.5 cm以上、至少具有1个节的茎段，直接插入或平铺在分化启动培养基上，14 d后，在茎段剪口处形成一圈白色丛生芽，每段茎段约可产生9- 20个不定芽，25 d后逐渐长成直径1-3 cm的丛生芽芽团，将这样的芽团切分成直径0.5-1 cm的小芽团进行继代增殖培养；（5）增殖继代培养将上一步骤中分化的各种器官类型离体根茎叶诱导产生的不定芽和各种类型...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄艳艳，罗磊，李国华，王玉山，赵进红，王新花，张继亮，
申请(专利权)人：泰安市泰山林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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