用于快速和全面T细胞免疫监测的细胞平台制造技术

用于T细胞表位库的高效和系统性鉴定的方法及系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年1月21日提交的美国临时申请No.61/929,651(其内容在此通过引用并入)的权益。政府支助的声明本专利技术是在由国立卫生研究院的NIGMS授予的基金号3U54GM094662-02和5U01GM094665-02下由政府支助进行的。政府具有本专利技术的某些权利。专利技术背景在整个本申请中，在方括号内提及各种出版物。这些参考文献的完整引文可见于本说明书的末尾。本文中提及的这些出版物和所有专利、专利申请出版物和书的公开内容在此通过引用整体并入本申请，以更全面地描述本专利技术所属的领域。在过去十年中在用于鉴定与临床上重要的疾病状态和对治疗的差异反应相关的分子标签的基因组学[13-15]和蛋白质组学技术[16-19]的开发和应用中已取得显著增长。这些进展有望用于个性化诊断[20]。作为一个例子，自适应生物技术利用T细胞受体(TCR)β链高变区的高通量测序，以为研究者提供样品内的TCR库的全面分析[21]。该风险投资资助的努力目前是有偿服务企业，生物标志物发现的预计市场深度达3亿美元。高通量技术的迅速进展一直伴随着生物制剂(例如，单克隆抗体、治疗性蛋白和肽)的逐步临床开发[22-25]，并且已彻底改变了免疫源性疾病的治疗。例如，与主要通过抗体反应加强免疫的常规疫苗不同，Genocea Biosciences正在开发基于生物制剂的新型疫苗，其集中于产生针对细胞内病原体的强劲的T细胞应答。同样地，Apitope(一个欧洲的生物技术公司)正在开发用于治疗其中T细胞起着关键致病作用的自身免疫性疾病的治疗肽。Aptiope最近与Merck-Serono联手持续开发它们的旗舰级MS肽治疗剂。寻求监测、增强或改变T细胞免疫的努力将在很大程度上取决于鉴定临床相关T细胞表位的能力。在包括CD8介导的适应性免疫应答的分子事件的核心的是T细胞受体(TCR)与由主要组织相容性复合物(MHC)分子非共价地呈递的小肽抗原(被称为T细胞表位)的接合。这代表了免疫系统的靶向机制并且是T细胞激活和效应子功能的必要分子相互作用。在T-细胞发育过程，基因组编辑过程导致独特的TCR在每一个免疫细胞上的表达，估计的深度超过300万个独特的序列[1]，并且解释了T细胞可对其响应的抗原的巨大多样性。然而，T细胞表位在历史上一直很难研究，因为每一个TCR需要在定制试剂(例如，四聚体)的特异性以及开发方面的个别表征以用于进一步研究。在临床上，该挑战是伴随着这样的事实，即免疫应答通常涉及许多T细胞特异性，例如靶向多个病毒抗原以实现单一病原体应答的病毒清除。因此，系统地鉴定针对给定的疾病状态的表位的整个系综的能力代表了针对感染性疾病、自身免疫和癌症的诊断剂和潜在的高度靶向治疗剂的开发的独特机会。存在许多用于表位发现的实验方法，所述方法包括表达[3,4]和合成肽文库[5,6]、位置扫描文库[7]、pMHC微阵列[8]的筛选，以及天然存在的表位[9-11]的质谱鉴定。Marrack和Kappler将杆状病毒感染的昆虫细胞策略开发为共价结合于潜在肽模拟表位的文库的I类MHC分子的展示平台[4]。模拟表位与未知肽表位相异在于序列，但它们仍然被特定的CD8T细胞受体识别。然而，通常具有挑战性的是将所鉴定的模拟表位连接至天然表位。此外，杆状病毒展示系统需要5-10轮费时的细胞分选、病毒产生、扩增和再感染来解析模拟表位，再加上对纯化和四聚化同源TCR的要求。在部分解决这些问题后，Newell等利用与流式细胞术和质谱法(称为质量细胞术)组合的MHC四聚体的重同位素标记来以惊人的灵敏度直接从人血样品筛选一小组pMHC四聚体组合，尽管这技术目前仅限于每次检测约100个这样的组合[12]。这些方法的每一种方法都已为T细胞表位贡献了有价值的见解；然而，这些方法速度慢，劳动强度大，并且需要高度用户技能。本专利技术解决了该对于用于T细胞表位库的高效系统性鉴定的新的改进的技术的需要。专利技术简述本专利技术提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：前导寡核苷酸序列，邻接有编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有编码荧光蛋白的寡核苷酸序列，邻接有编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链跨膜结构域的寡核苷酸序列。本专利技术还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白，邻接有第四接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。还提供了重组核酸，其以5’至3’顺序包含：编码前导寡核苷酸序列的序列，邻接有编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白，邻接有第四接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。还提供了鉴定T细胞的方法，所述方法包括：将T细胞与包含至少两个细胞的多个分离的悬浮-适应细胞接触，每一个细胞表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物，所述表达产物的每一种包含8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白，邻接有第四接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链跨膜结构域，其中所述多个分离的悬浮-适应细胞在允许T细胞与所述8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽缀合的条件下，在其细胞当中表达至少两种不同编码的8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽；回收已与悬浮-适应细胞形成缀合物的T细胞；从所述回收的T细胞回收DNA；对所述回收的DNA进行测序；鉴定在所述DNA中编码的所述8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，以从而鉴定T细胞表位。还提供了由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：前导寡核苷酸序列，邻接有编码8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链跨膜结构域的寡核苷酸序列。还提供了表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含:8个、9个、10个、11个或12个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮‑适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：前导寡核苷酸序列，邻接有编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有编码荧光蛋白或编码免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.21 US 61/929,6511.一种由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：前导寡核苷酸序列，邻接有编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有编码荧光蛋白或编码免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的分离的悬浮-适应细胞，其中所述细胞由异源核酸转导或用异源核酸转染，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：前导寡核苷酸序列，邻接有编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有编码免疫球蛋白Fc结构域寡核苷酸序列，邻接有编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的分离的悬浮-适应细胞，其中所述细胞由异源核酸转导或用异源核酸转染，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：前导寡核苷酸序列，邻接有编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头的寡核苷酸序列，邻接有编码荧光蛋白的寡核苷酸序列，邻接有编码第四接头的寡核苷酸序列，邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。4.一种表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有第四接头肽序列，邻接有哺乳动物跨膜结构域。5.一种膜结合部分，所述膜结合部分表达权利要求4的细胞的表达产物。6.根据权利要求4或5所述的细胞的膜结合部分，所述膜结合部分是微囊泡或外来体。7.根据权利要求4、5、6或7所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述细胞表达包含所述免疫球蛋白Fc结构域的序列的表达产物。8.根据权利要求4、5或6所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述细胞表达包含所述荧光蛋白的表达产物。9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。10.根据权利要求1-3、7、8或9中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞，其中所述异源核酸还包含相对于编码所述哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列在3’的编码病毒包装序列的寡核苷酸。11.根据权利要求4-9中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述表达产物还包含相对于所述哺乳动物跨膜结构域在C末端的病毒包装序列。12.一种膜结合部分，所述膜结合部分表达作为病毒样颗粒的权利要求11的细胞的表达产物。13.根据权利要求1-12中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述β2微球蛋白具有与人β2微球蛋白相同的序列。14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中主要组织相容性复合物重链序列具有与人HLA-A序列相同的序列。15.根据权利要求1-14所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中跨膜结构域具有与人主要组织相容性复合物I重链跨膜结构域相同的序列。16.多个根据权利要求1-15中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或多个表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，其中所述多个包括至少两个不同编码的5至20个氨基酸的肽。17.根据权利要求16所述的多个，其中所述多个包括至少100个不同编码的5至20个氨基酸的肽。18.根据权利要求中1-15中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，或所述多个根据权利要求16或17的分离的悬浮-适应细胞或膜结合部分，其中所述编码的肽是九聚体或是多个九聚体。19.根据权利要求1-15中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞或其膜结合部分，或所述多个根据权利要求16、17或18的分离的悬浮-适应细胞或其膜结合部分，其中所述编码的肽或多个肽存在于所述细胞的细胞外表面上。20.根据权利要求1-19中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞的膜结合部分，所述膜结合部分表达所述表达产物。21.根据权利要求1-19中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞。22.根据权利要求10-19或21中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞，其中异源核酸编码所述病毒包装序列，并且其中所述细胞被包含所述异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转导或用包含所述异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转染。23.一种(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，所述病毒样颗粒或病毒由权利要求22的细胞产生，所述病毒样颗粒或病毒经由具有通过哺乳动物跨膜结构域附接于其的表达产物的细胞膜部分物理缔合，所述表达产物按N末端至C末端的顺序包含：5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的序列，邻接有第四接头肽序列，邻接有所述哺乳动物跨膜结构域，邻接有病毒包装序列。24.根据权利要求23所述的(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，其中使用逆转录病毒转染系统来转染所述细胞。25.根据权利要求23所述的(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，其中使用慢病毒转染系统实现所述转染。26.根据权利要求23、24或25所述的(i)病毒样颗粒或(ii)病毒，其中所述逆转录病毒转染系统包含在其中具有替代编码一个或多个包膜蛋白的寡核苷酸序列或多个寡核苷酸序列的编码以下的寡核苷酸序列或多个寡核苷酸序列的包装质粒：5至20个氨基酸的肽，邻接有第一接头肽序列，邻接有β2微球蛋白序列，邻接有第二接头肽序列，邻接有主要组织相容性复合物重链序列，邻接有第三接头肽序列，邻接有荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域，邻接有第四接头肽序列，邻接有所述哺乳动物跨膜结构域。27.根据权利要求23-26中任一项所述的分离的病毒，所述病毒已从所述细胞出芽。28.根据权利要求23-26中任一项所述的分离的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒已从所述细胞出芽。29.一种从所述细胞出牙的权利要求27的分离的病毒，所述病毒是重组逆转录病毒。30.多个根据权利要求27或29所述的分离的病毒。31.多个根据权利要求28所述的分离的病毒样颗粒。32.多个分离的病毒，其中所述多个包含相异在于其所述编码的5至20个氨基酸的肽的病毒。33.多个分离的病毒样颗粒，其中所述多个包含相异在于其所述编码的5至20个氨基酸的肽的病毒样颗粒。34.一种重组核酸，所述重组核酸以5’至3’顺序包含：编码前导寡核苷酸序列的序列，邻接有编码5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一接头的寡核苷酸序列，邻接有编码β2微球蛋白序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二接头的寡核苷酸序列，邻接有编码主要组织相容性复合物重链序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三接头肽序列的寡核苷酸序列，邻接有编码荧光蛋白或免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列，邻接有编码第四接头肽序列的寡核苷酸序列，邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。35.根据权利要求34所述的重组核酸，所述重组核酸包含编码所述荧光蛋白的寡核苷酸序列。36.根据权利要求34所述的重组核酸，所述重组核酸包含编码所述免疫球蛋白Fc结构域的寡核苷酸序列。37.根据权利要求34、35或36所述的重组核酸，其中所述哺乳动物跨膜结构域是主要组织相容性复合物重链跨膜结构域。38.根据权利要求34-37中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸还包含相对于编码所述哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列在3’的编码病毒包装序列的寡核苷酸。39.根据权利要求34-38中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸是载体。40.根据权利要求39所述的重组核酸，其中所述载体是病毒载体。41.根据权利要求40所述的重组核酸，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。42.根据权利要求41所述的重组核酸，其中所述载体是质粒。43.根据权利要求1-15、18、19、21或22中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞，或多个根据权利要求16-17中任一项所述的分离的悬浮-适应细胞，或根据权利要求34-42中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸包含cDNA。44.一种由异源核酸转导或用异源核酸转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与人天然B2M肽序列同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第二氨基酸接头序列的寡核苷酸序列，邻接有编码预选的第二肽序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第三氨基酸接头的寡核苷酸序列，邻接有编码第二B2M前导序列的寡核苷酸序列，邻接有编码与MHC重链同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第四氨基酸接头的寡核苷酸序列，邻接有编码与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列的寡核苷酸序列，邻接有编码第五接头的寡核苷酸序列，邻接有编码哺乳动物跨膜结构域的寡核苷酸序列。45.一种表达在其中转导或转染的异源核酸的表达产物的分离的悬浮-适应细胞，或表达所述表达产物的此类细胞的膜结合部分，所述表达产物包含重组多肽构建体，所述重组多肽构建体包含(i)被第一氨基酸接头序列结合的预选的5至20个氨基酸的肽，邻接有包含与人天然B2M肽序列同一的序列的氨基酸的序列，邻接有第二氨基酸接头序列，邻接有预选的第二肽序列，其中(i)通过一个或一个以上的二硫键结合于(ii)具有MHC重链的序列的氨基酸的序列，邻接有第四氨基酸接头序列，邻接有与免疫球蛋白Fc结构域同一的氨基酸的序列，邻接有第五氨基酸接头，邻接有哺乳动物跨膜结构域。46.一种被包含异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转导或用包含异源核酸的病毒、质粒或病毒载体转染的分离的悬浮-适应细胞，所述异源核酸以5’至3’顺序包含：编码第一B2M前导序列的寡核苷酸序列，邻接有编码预选的5至20个氨基酸的肽的寡核苷酸序列，邻接有编码第一氨基酸接头序列的寡核...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·D·塞戴尔第三，R·查帕罗，B·S·希勒里希，S·C·阿尔莫，
申请(专利权)人：阿尔伯特·爱因斯坦医学院股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US