本发明专利技术公开了一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8‑12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24‑26℃发酵培养8‑14天，在发酵第4‑8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。本发明专利技术通过在发酵中期加入真菌激发子刺激桦褐孔菌的生长，无需引入基因工程菌株或外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中白桦脂酸的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物发酵及代谢领域，尤其涉及一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法。
技术介绍
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日本北海道等北半球北纬40°～50°的地区和我国的黑龙江大兴安岭、吉林长白山一带。从16世纪以来，俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就广泛使用桦褐孔菌来治疗各种疑难杂症，如各种癌症、心脏病和糖尿病等。桦褐孔菌是生长在寒带的木腐菌，引起白桦、银桦、榆树、赤杨的白腐。在木材中的桦褐孔菌菌丝在零下40℃也不会冻死，是极耐寒的种类。桦褐孔菌含有多糖、三萜类、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。其中，白桦脂酸，是一种非常重要的天然活性物质。白桦脂酸(Betulinic acid，BA)，又名桦木酸，是一种五环三萜类化合物。广泛分布于多种植物中，如鼠李科的酸枣仁、桦木科的白桦树皮、豆科的皂角刺、蔷薇科的光皮木瓜、五加科刺五加、大戟科重阳木、锦葵科木芙蓉花等。最早分离于生长在非洲东部的鼠李科常绿植物的树皮。在我国，白桦脂酸最丰富的自然资源是白桦树皮。近年来的研究表明，白桦脂酸具有诸多的生物活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤方面，特别是针对黑色素瘤，有突出的表现。同时还具有作用机制特异、分子质量小、低毒性等优点，有广泛的应用开发前景，是一类很有潜力的药物先导化合物。目前，白桦脂酸的来源主要有三种：第一，从天然植物中提取分离得到。第二，以白桦脂醇为前体，通过有机合成得到白桦脂酸。第三，以白桦脂醇为前体，通过微生物生物转化形成白桦脂酸。目前，有研究表明，桦褐孔菌中可以分离到白桦脂酸。但是，在实验的过程中，发现从桦褐孔菌中直接提取白桦脂酸时，得到的量非常低，几乎没有，所以希望找到一种更为高效的提高白桦脂酸产量的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，该方法无需引入基因工程菌株或外加酶，后处理简单，能有效提高桦褐孔菌中白桦脂酸的产量。一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：(1)将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8-12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；(2)将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第4-8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸；其中，所述可产孢子的丝状真菌为刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌中的至少一种。白桦脂酸属于一种次生代谢产物，主要在桦褐孔菌的代谢过程中产生，桦褐孔菌的发酵周期一般为12天。真菌激发子是来源于真菌的一类化学物质，具有诱导细胞中防卫基因的表达并促进细胞中特定次生代谢产物的合成等功能，在植物或微生物的次级代谢产物合成的研究过程中，被广泛用做诱导物质。本专利技术在研究中发现，在发酵中期加入真菌激发子可有效提高桦褐孔菌中白桦脂酸的含量。本专利技术中，所述真菌激发子可采用如下方法制备：将可产孢子的丝状真菌接种于PDA培养基并在25±1℃培养7d，然后转入PDB液体培养基中，25℃条件下震荡培养3d(摇床转速为140r/min)；培养完成后，于3500r/min离心10min，菌丝体用蒸馏水洗涤3次，用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.2)洗涤3次，采用超声波细胞粉碎机破碎细胞(300W，1min×5)，3500r/min离心10min后取沉淀，在显微镜下观察时，菌丝体应均为碎片状；然后用上述缓冲液洗涤3次，蒸馏水洗涤3次；用蒸馏水配制成一定浓度的细胞碎片溶液，高压蒸汽灭菌后，得到真菌激发子；放4℃冰箱中保存备用。所述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号CFCC 83414。所述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414活化用的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基可以为市售产品。所述固体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.8％，氯霉素0.01％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。固体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖琼脂合成培养基，混匀，煮沸，分装在玻璃管中，之后在121℃下灭菌20min，灭菌后摆成斜面待其凝固。所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。马铃薯葡萄糖合成培养基可以为市售产品。所述液体培养基中原料质量百分比组成可以为：马铃薯浸出粉0.8％，葡萄糖2％，余量为麸皮水浸提液；其中，麸皮水浸提液为麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，经熬制、除杂后得到。液体培养基可以通过如下方法制备：将麸皮按照4-6％质量百分比浓度加入水中，熬制0.4-0.6小时后用八层纱布过滤除去大颗粒；然后加入马铃薯葡萄糖合成培养基，混匀，分装，之后在121℃下灭菌20min。采用此培养基配方，更有利于菌体的生长和代谢。所述发酵温度可以为25℃，发酵时间可根据发酵方式不同而不同。当采用发酵罐发酵时，培养时间可以为8-10天；当采用三角瓶发酵时，发酵时间可以为11-14天。本专利技术研究发现发酵罐处理效果更好，发酵罐与三角瓶相比，不易污染，通气量大，溶氧充分，同时，由于桦褐孔菌是好氧真菌，故用发酵罐生长更快，发酵周期更短。三角瓶发酵培养时，前2-3天转速设为0rpm/min，然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，之后再以150-180r/min的转速培养。先静置2-3天，是因为刚接种后，培养基中菌体较少，所需要的氧气也较少；然后再以90-110rpm/min的转速培养2-3天，是因为这个时期，菌体已经在逐渐增多，所以要适当增大转速，以满足其对氧气的需求。之后再以150-180r/min的转速培养，是因为此时其菌体量已经达到其最大值，所以要适当加大转速。这样设置转速，更有利于菌体生长和代谢。优选地，所述可产孢子的丝状真菌为黑曲霉。通过对刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌这四类真菌的激发子进行初步比较，结果发现黑曲霉激发子诱导效果最佳。所述真菌激发子的加入时间可以为发酵第4-5天。因为此时添加，发酵后得到的白桦脂酸的量最多。以每升发酵液计，所述真菌激发子的添加量可以为10-90mg；优选为30-60mg；更优选为45mg。因为加入激发子的量过少时，诱导效果不明显；激发子加入量过高时，将会抑制白桦脂酸的产生。所述后处理包括将菌体破碎后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：(1)将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8‑12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；(2)将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24‑26℃发酵培养8‑14天，在发酵第4‑8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸；其中，所述可产孢子的丝状真菌为刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌中的至少一种。
【技术特征摘要】
1.一种利用真菌激发子诱导从桦褐孔菌中提取白桦脂酸的方法，包括：(1)将可产孢子的丝状真菌进行液体培养，培养后离心、洗涤得到菌丝体，破碎细胞，离心取沉淀，然后用蒸馏水配制成浓度为8-12mg/mL的细胞碎片溶液，灭菌，得到真菌激发子；(2)将活化的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414接入液体培养基，于24-26℃发酵培养8-14天，在发酵第4-8天加入真菌激发子，发酵完成后，分离菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸；其中，所述可产孢子的丝状真菌为刺盘孢菌、黑曲霉、米曲霉和尖孢镰刀菌中的至少一种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖合成培养基和麸皮水浸提液的混合物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵采用发酵罐发酵，发酵时间为8-10天。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈启和，李豪，胡竞进，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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