一种高效基因克隆方法及其应用技术

本发明专利技术公开了DNA分子克隆的方法和成份。本发明专利技术的方法包括通过使用基于切刻内切酶的引物设计方法制备带有粘性末端的DNA片段，和将DNA片段与克隆载体连接，其中所述DNA片段和所述载体片段带有互补的粘性末端。本方法高效，可用于克隆大小为12Kb的DNA片段。本发明专利技术还公开了多DNA片段的一步定向连接方法和商业化基因克隆试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
：本专利技术属于分子生物学
，特别涉及一种基于切刻内切酶的高效基因克隆方法及其应用。
技术介绍
：PCR作为分子生物学的一项基本技术，是目前体外DNA扩增最常用的方法。PCR扩增产物的克隆是对其进行测序、载体的构建、体外转录、体外翻译、生物体内基因表达和功能分析等多种用途的必经之路。目前存在多种克隆DNA片段的方法，最常用的是TA克隆(Holton，T.A.et al.1991.Nucleic Acids Research.19(5)：1156)。该方法中载体DNA 3’端突出1个“T”碱基，与插入的PCR扩增产物3’端突出的1个“A”碱基形成了碱基互补配对，再经T4 DNA连接酶的连接作用完成TA克隆的过程。但是，传统的TA克隆方法存在一些缺点：1)单个突出的T或A碱基悬挂不稳定，常常在回收或反复冻融时丢失；2)所有种类的T载体与PCR产物通过TA二氢键连接，而粘性末端只有一个碱基，因此，TA连接的键能较弱；3)DNA片段的连接是分子碰撞的过程，实际上是概率事件，因此连接效率不能达到最佳；4)当连接长度大于5 Kb的PCR产物时效率较低(Szaty lowicz and Sadlej-Sosnowska，2010.J.Chem.Inf.Model.50(12)，2151-61)；6)在面对需要定向克隆PCR产物时(如Gateway反应)，一般的TA克隆载体也无法进行单一性方向的连接，需要在连接转化后再挑选连接方向正确的克隆(Peijun et al.2010.Curr IssuesMol Biol.12，11-16)。目前存在的其它DNA片段克隆方法(Champoux.2001.Annu Rev Biochem.70，369-413；Cheo et al.2004.Genome Res.14，2111-20；van den Ent and Lo..we.2006.J Biochem Biophys Methods.67，67-74)也存在连接效率低、步骤复杂、DNA片段不能定向连接等问题，因此需要一个高效的并能克服上述问题的克隆方法。专利技术概述本专利技术公开了基因克隆的方法。在一个实施方案中，公开了一种基因克隆方法，其包括的步骤为，制备带有粘性末端的DNA片段；将所述DNA片段与带有的粘性末端的克隆载体连接，其中所述DNA片段的粘性末端与所述克隆载体的粘性末端互补；和将连接产物转化感受态细胞。所述带有粘性末端的DNA片段通过以下步骤获得：1)使用一对特异的引物扩增目的DNA片段，其中一对引物中至少一个引物由5’端的额外碱基和与目的DNA片段末端互补的碱基序列组成，额外碱基包括切刻内切酶识别位点或者包括5’端至少一个保护碱基和与之相连的切刻内切酶识别位点；2)使用所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切扩增的DNA片段；3)变性去除被切刻下的单链结构。0～10个保护碱基A、G、C或T以任意方式排布添加在引物的5’末端。所述DNA片段可以是一个末端为粘性末端，另一个末端为平末端；也可以是两个末端均为粘性末端。所述引物对可以带有相同的限制性内切酶识别位点，也可以是带有不同的限制性内切酶的识别位点。切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII。在一个实施方案中，切刻内切酶是Nb.BbvCI。克隆载体是线性的，带有一个或者两个粘性末端，线性克隆载体通过酶切初始载体或者按照如下的步骤制备：1)制备两端为II型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；2)将1)中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；和3)使用间隔子识别位点对应的II型限制性内切酶酶切前克隆载体。在某些方面，间隔子序列的长度至少为300bp。间隔子序列两端的II型限制性内切酶识别序列可以不同，也可以相同。间隔子可以是选择标记，例如ccdB基因。初始载体选自PBR322载体、PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。在一个实施例中，克隆载体是pMD19GW-Adv.BstX-BstXI。本专利技术中基因克隆方法可用于克隆长度大于12Kb的DNA片段。在另一个实施例中，公开了将多个DNA片段一步定向克隆到载体中的方法。在本方法中，首先获得带有预先设计的可变粘性末端的多DNA片段，所述带有可变粘性末端的DNA片段通过使用一对特异的引物扩增目的DNA片段，使用所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切扩增的DNA片段，并去除酶切的单链结构的小片段获得。每一个引物针对特定目的片段进行扩增，引物对中的每一引物由5’端的额外碱基和与特定目的DNA片段末端互补的碱基序列组成，其中额外碱基包括切刻内切酶识别位点或者包括至少一个保护碱基和与之相连的一个切刻内切酶识别位点。可变粘性末端通过改变切刻内切酶识别位点和/或通过改变添加在引物5’端保护碱基的个数和排列方式产生。连接反应时，DNA片段之间和克隆载体根据碱基互补配对原则依赖粘性末端碱基配对定向连接，最后将连接产物转化感受态细胞。为了创造粘性末端，0～10个保护碱基A、G、C或T以任意方式排列添加在5’末端。切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII。在一个实施例中，切刻内切酶是Nb.BbvCI。克隆载体是线性化并带有一个或者两个粘性末端，线性克隆载体通过酶切初始载体或者按照如下的步骤制备：1)制备两端为II型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；2)将1)中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；和3)使用间隔子识别位点对应的II型限制性内切酶酶切前克隆载体。在某些实施例中，间隔子序列的长度至少为300bp。间隔子序列两端的II型限制性内切酶识别序列可以不同，也可以相同。间隔子可以是选择标记，例如ccdB基因。初始载体选自PBR322载体、PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。在一个实施例中，克隆载体是pMD19GW-Adv.BstX-BstXI。多DNA片段一步定向克隆方法可用于构建包括RNAi载体在内的载体。附图说明和序列表根据以下的专利技术详述和附图及序列表，可以更全面地理解本专利技术，以下的专利技术详述和附图及序列表形成本申请的一部分。序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA片段克隆方法，所述方法包括：a.获得带有粘性末端的DNA片段，其中所述DNA片段通过以下的步骤获得：Ⅰ.使用一对引物扩增目的DNA片段，其中所述一对引物中至少有一个引物由5’端额外碱基和一段与目的DNA片段特异互补的碱基组成，所述的额外碱基由一个切刻内切酶识别位点或由至少一个保护碱基与切刻内切酶识别位点组成；Ⅱ.使用与所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切步骤Ⅰ扩增的DNA片段；和Ⅲ.变性去除酶切的单链结构；b.将a中的DNA片段与克隆载体连接，所述克隆载体带有与所述DNA片段粘性末端互补的粘性末端；和c.将步骤b中的连接产物转化感受态细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种DNA片段克隆方法，所述方法包括：a.获得带有粘性末端的DNA片段，其中所述DNA片段通过以下的步骤获得：Ⅰ.使用一对引物扩增目的DNA片段，其中所述一对引物中至少有一个引物由5’端额外碱基和一段与目的DNA片段特异互补的碱基组成，所述的额外碱基由一个切刻内切酶识别位点或由至少一个保护碱基与切刻内切酶识别位点组成；Ⅱ.使用与所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切步骤Ⅰ扩增的DNA片段；和Ⅲ.变性去除酶切的单链结构；b.将a中的DNA片段与克隆载体连接，所述克隆载体带有与所述DNA片段粘性末端互补的粘性末端；和c.将步骤b中的连接产物转化感受态细胞。2.根据权利要求1所述的方法，所述保护碱基的个数为0～10个，所述保护碱基添加在所述引物的5’末端。3.根据权利要求1所述的方法，所述保护碱基为任意方式排列的A、G、C或T。4.根据权利要求1所述的方法，所述的获得的DNA片段一端为粘性末端，另一端为平末端。5.根据权利要求1所述的方法，所述获得的DNA片段两端均为粘性末端。6.根据权利要求1所述的方法，所述一对引物对带有相同的切刻内切酶识别位点。7.根据权利要求1所述的方法，所述一对引物对带有不同的切刻内切酶识别位点。8.根据权利要求1所述的方法，所述切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII。9.根据权利要求1所述的方法，所述切刻内切酶是Nb.BbvCI。10.根据权利要求1所述的方法，所述变性步骤包括65℃孵育5min。11.根据权利要求1所述的方法，所述的克隆载体通过酶切初始载体获得。12.根据权利要求1所述的方法，所述克隆载体由以下步骤获得：a.制备两端带有Ⅱ型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；b.将a中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；和c.使用间隔子识别位点对应的Ⅱ型限制性内切酶酶切前克隆载体。13.根据权利要求12所述的方法，所述间隔子序列的长度至少为300bp。14.根据权利要求12所述的方法，所述间隔子是选择标记。15.根据权利要求14所述的方法，所述选择标记是ccdB。16.根据权利要求12所述的方法，所述间隔子序列两端的Ⅱ型限制性内切酶识别位点不同。17.根据权利要求12所述的方法，所述间隔子序列两端的限制性内切酶的识别位点相同。18.根据权利要求11或者12所述的方法，初始载体选自PBR322载体、PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。19.根据权利要求1所述的方法，所述克隆载体是pMD19GW–Adv.BstX–BstXI。20.根据权利要求1所述的方法，所述的DNA片段长度可达12Kb。21.一种将多DNA片段一步定向克隆到载体中的方法，所述方法包括如下的步骤：a.获得带有可变粘性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军华，毛冠凡，
申请(专利权)人：先锋海外公司，
类型：发明
国别省市：美国;US