制备人血浆蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及通过多柱色谱方法自血浆制备血浆蛋白浓缩物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及自血浆或血浆成分制备用于治疗用途的人血浆蛋白的方法。
技术介绍
许多病理目前采用富含一或多种血浆蛋白的血浆成分治疗。因此，在替代疗法中通常采用凝血因子预防或治疗与凝血因子缺乏相关的出血。纤维蛋白原最常被处方用于治疗与先天性或严重无纤维蛋白原血症相关的并发症以及与低纤维蛋白原血症相关的出血综合征或出血风险。白蛋白用于恢复并维持循环血量(确诊的血量过低)。同样，许多病理目前采用富含免疫球蛋白的血浆成分治疗，特别是富含免疫球蛋白G(IgG)，通常含有95％以上的Ig。例如，富含免疫球蛋白G或IgG浓缩物的血浆成分可以用于修正原发性免疫缺陷缺乏抗体的产生以及某些继发性免疫缺陷，例如白血病、骨髓瘤或复发性感染等。Ig的给药在下列疾病的治疗中也可以发挥有益的作用：青少年和成人特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格林巴利综合征(Guillain-Barré syndrome)、脱髓鞘性多发性神经病变、多灶性运动神经病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、川崎病、多发性硬化症、激素耐药性皮肌炎、急性肌无力、Birdshot视网膜脉络膜炎、由于胎儿-母亲ABO不相容导致的新生儿黄疸(由于ABO不相容导致的新生儿溶血性疾病)等。多种治疗适应症以及在某些情况下可以处方的极高剂量(多达2g的免疫球蛋白/kg/天)导致了供应的极度紧张，在欧洲和美国几乎出现了断货的情况。同样，已经开发了许多方法用于自血浆中纯化血浆蛋白。使其能够提取细血浆蛋白用于治疗用途的工业化方法被称为“血浆分馏法(plasma fractionation)”。现今使用的分馏技术通常自冷沉淀步骤开始，包括于低温下融化血浆以便于分离富含因子VIII、血管性血友病因子、纤维蛋白原和纤连蛋白的冷凝蛋白。随后，上清液部分(冷上清液)的蛋白可以通过在乙醇存在下的连续沉淀进行分离(Cohn等,1946,J.Am.Chem.Soc.68,459)。同样还描述了采用乙醇分馏的经典Cohn方法的多个变通方法。因此，Tanaka K.等,2000(Braz J Med Bio Res 2000,33(1):27－30)的文章描述了用于纯化免疫球蛋白G的方法：采用根据Cohn方法的乙醇分馏后获得的“I+II+II”和“II+III”组分作为原料，通过三种类型的凝胶、二种离子交换凝胶进行色谱分离(Q-Sepharose FF和Cm-Sepharose FF)以及凝胶过滤步骤(Sephacryl S-300HR)。乙醇沉淀的替代路线已经经Steinbuch等报道(Rev.Franc.Et.Clin.and Biol.1969,XIV,1054)，其采用辛酸(或辛酸/辛酸酯)沉淀。后者可以自血浆中沉淀大部分蛋白并且在上清液中保留免疫球蛋白。这些免疫球蛋白的纯化通过在阴离子交换树脂DEAE-纤维素上吸附(以“批次”的形式)进行，其也可以将免疫球蛋白留在上清液中。然后，后者可以通过超滤浓缩。然而，这些乙醇或辛酸沉淀物使得蛋白发生一定程度的变性并形成蛋白聚集物(特别是免疫球蛋白聚合物)，这可以导致过敏反应。因此，必须进行后续处理步骤，例如采用丙内酯或者采用还原剂和烷化剂或者于pH 4或者采用PEG来沉淀聚集物。这些额外的步骤有可能降低血浆蛋白收率。因此，大多数生产方法要求IgG收率为每升分馏的血浆含有3.5－5.5g的IgG(“一种具有高收率和有效病毒清除的用于自人血浆生产免疫球蛋白G的改良辛酸方法(A modified carprylic acid method for manufacturing immunoglobulin G from human plasma with high yield and efficient virus clearance)”-Vox Sang.2006Feb；90(2):97－104和“一种采用两阶段病毒灭活过程生产多价静脉注射免疫球蛋白溶液的新方法(A new methodology for polyvalent intravenous immunoglobulin solution production with a two-stage process of viral inactivation)”-Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol.46,n.4,Oct./Dec.,2010)。此外，乙醇分馏的使用相对昂贵。的确，1升血浆需要使用2升乙醇。因此，为了处理数千升血浆，在生产场地必须储备大量的乙醇，还必须冷却该系统以便于进行乙醇分馏。此外，工业设施必须适合于储存、处理、销毁以及有可能需要回收大量的溶剂，这些造成了严重的技术障碍和巨额的费用。血浆蛋白的纯度是保证使用期间疗效和安全性最好的关键指标。因此，乙醇或辛酸分馏必须通过其它纯化步骤加以补充以便于获得需要的纯度，但是由于产品额外的损失这些操作不利于获得较好的收率。就这些额外的步骤而言，色谱技术越来越多地被使用，因为它们的特征在于高度的纯化以及高收率。因此，在最初的血浆处理中尽可能地采用这些色谱技术以便于提高收率和纯度，同时保留目标蛋白的完整性。这已经应用于捕获相对匮乏的血浆蛋白，例如因子XI、因子IX、因子VIII、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、蛋白C、抗凝血酶III等。但是对于高丰度蛋白例如多价免疫球蛋白、白蛋白和纤维蛋白原而言，捕获这些分子所需要的色谱凝胶的量会非常大，导致工业设备无法盈利(设备大小和凝胶的成本高昂)。尽管某些文献描述了将用于处理大量蛋白的色谱循环进行叠加(accumulation)(“用于制备人血浆白蛋白的工业色谱单元的说明和评价(Description and assessment of an industrial chromatography unit for preparing human plasma albumin)”-Biotechnology of Blood Proteins1993,第227卷,第176－181页)，但是这些方法都不是最佳的，开发的也不好。因此，仍然急需增加用于治疗用途的血浆蛋白的生产收率的方法，特别是免疫球蛋白、白蛋白和/或纤维蛋白原，同时保证最终产品的高纯度并且不含可能有害的杂质。
技术实现思路
专利技术概述一般而言，本专利技术涉及以高收率制备纯化的人血浆蛋白组分的方法，所述收率特别是高于本领域技术人员已知的方法的收率。为此，申请人开发了自血浆制备纯化的人血浆蛋白浓缩物的方法，该方法包括至少一个通过多柱色谱的纯化步骤，特别是通过多柱亲和或离子交换色谱或疏水作用或化学配体结合的多柱色谱(多模式(multi-modal))。更确切地说，本专利技术的方法建议通过下列方法实施色谱步骤，即将常用的色谱柱分为多个较小的柱，其可以串联放置或者各自独立控制。一方面，采用多柱色谱的此类步骤使其能够最大程度地利用色谱凝胶上的官能团，另一方面，使其能够极大地减少每一血浆蛋白制备批次所使用的色谱凝胶的体积。本专利技术还涉及以高于本领域技术人员已知方法的收率制备人免疫球蛋白(Ig)浓缩物的方法。为此，申请人开发了制备纯化的Ig的方法，其中最初的采用乙醇和\本文档来自技高网...

【技术保护点】
自血浆制备用于治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物的方法，该方法包括对血浆或血浆成分进行多柱色谱的纯化步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.11 FR 14519971.自血浆制备用于治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物的方法，该方法包括对血浆或血浆成分进行多柱色谱的纯化步骤。2.权利要求1的方法，其中所述血浆成分选自冷沉淀的血浆上清液、再悬浮的血浆冷沉淀物、通过乙醇分馏的馏分I-V、采用辛酸和/或辛酸酯沉淀获得的上清液和沉淀物、通过色谱处理而没有被保留的洗脱液或组分、滤液。3.权利要求1或2的方法，其中用于治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物包括选自下列的血浆蛋白：免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子，例如纤维蛋白原(因子I)、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI、因子XIII、血管性血友病因子、凝血酶原复合物或PPSB(因子II、VII、IX、X)、激活的凝血酶原复合物、生物粘附剂和蛋白酶抑制剂，例如α-1抗胰蛋白酶、C1-酯酶抑制剂或抗凝血酶，单一或混合物形式、α/巨球蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、Apo A、Apo B、Apo C、Apo D、Apo E、Apo F、Apo G、βXIIa、C-反应蛋白、C7、C1r、C1s、C2C3、C4、C4bP、C5、C6、C1q、C8、C9、羧肽酶N、血浆铜蓝蛋白、因子B、因子D、因子H、纤连蛋白、触珠蛋白、血红素结合蛋白、肝素辅助因子II、组蛋白富集GP、激肽酶II、激肽原HPM、溶菌酶、PAI 2、PAI I、PCI、纤溶酶、纤溶酶抑制剂、纤溶酶原、前白蛋白、前激肽释放酶、备解素、蛋白酶连接蛋白INH、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、血清淀粉样蛋白(SAP)、TFPI、硫醇蛋白酶、血栓调节蛋白、组织因子(TF)、TPA、钴胺传递蛋白II、皮质素传递蛋白、转铁蛋白、玻连蛋白。4.前述权利要求中任一项的方法，其中用于治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物为免疫球蛋白浓缩物。5.权利要求1－3中任一项的方法，其中用于治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物为白蛋白和/或纤维蛋白原浓缩物。6.前述权利要求中任一项的方法，其中用于治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物为纤维蛋白原和/或白蛋白和免疫球蛋白浓缩物。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多柱色谱为多柱亲和色谱。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述血浆或冷沉淀的血浆上清液直接通过包括多柱亲和色谱的人免疫球蛋白的纯化步骤进行处理。9.权利要求8的方法，其中所述多柱亲和色谱的亲和配体选自对IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有亲和性的配体。10.权利要求7－9中任一项的方法，其中所述多柱亲和色谱采用选自下列的亲和配体：抗体、抗体片段、抗体衍生物、化学配体例如肽类、模拟肽类、类肽类、nanofitins和寡核苷酸配体，如寡核苷酸适配子。11.权利要求7－10中任一项的方法，其中所述多柱亲和色谱采用选自对消毒条件和/或与工业用途相匹配的多次重复利用有抗性的亲和配体，特别是选自肽类、类肽类、nanofitins和寡核苷酸适配子。12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多柱色谱为多柱离子交换色谱，例如多柱阴离子-或阳离子-交换色谱，或多柱疏水作用色谱，或多柱混合模式色谱或多柱排阻色谱。13.权利要求12的方法，其中所述多柱阴离子交换色谱在采用DEAE或TMAE或QAE基团接枝的交联多糖凝胶或乙烯基或丙烯酸聚合物凝胶上进行。14.权利要求13的方法，其中所述多柱阴离子交换和/或混合模式色谱在高度耐盐基质上进行以便于捕获在高盐度介质中的血浆蛋白，例如没有被色谱保留的血浆或成分。15.权利要求1－14中任一项的方法，其中对血浆或冷沉淀的血浆上清液直接进行人免疫球蛋白纯化的步骤，包括多柱阴离子交换色谱，任选将其中包含所述人免疫球蛋白的组分采用辛酸进行沉淀的后续步骤，并收集包含免疫球蛋白的上清液。16.权利要求1－15中任一项的方法，其中对血浆或冷沉淀的血浆上清液直接进行白蛋白和/或纤维蛋白原的纯化步骤，包括多柱亲和色谱或多柱阴离子交换色谱，任选将其中包含白蛋白和/或纤维蛋白原的组分采用辛酸进行沉淀的后续步骤，并收集包含白蛋白和/或纤维蛋白原的组分。17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多柱色谱包括串联的3－8个柱，优选3－5个柱和/或其中多柱色谱柱为径向柱。18.前述权利要求中任一项的方法，该方法进一步包括至少一个下列步骤：-去脂和/或过滤步骤；-采用辛酸的沉淀步骤；-病毒灭活或消除步骤，任选包括进行溶剂-清洁剂处理和/或纳米过滤；-离子交换色谱步骤，特别是阴离子或阳离子交换色谱步骤，所述阴离子交换色谱步骤优选在采用DEAE或TMAE或QAE基团接枝的交联多糖凝胶或乙烯基聚合物凝胶上进行；-抗A和抗B抗体消除步骤，特别是通过亲和色谱进行消除，例如多柱亲和色谱；-通过超滤进行浓缩的步骤；-配制步骤。19.前述权利要求中任一项的方法，该方法还包括配制步骤，包括向有治疗用途的纯化的血浆蛋白浓缩物中加入一或多种药学上可接受的稳定剂，任选还包括在配制步骤结束时将获得的药物制剂冷冻或冷冻干燥的步骤。20.前述权利要求中任一项的方法，该方法依次包括：(a)采用溶剂/清洁剂对血浆进行灭活的第一步骤；(b)通过多柱亲和色谱对步骤(a...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·巴塔勒，A·施图鲁，P·圣安比恩，
申请(专利权)人：法国血液分割暨生化制品实验室，
类型：发明
国别省市：法国;FR