一种采用灌注‑压差法制备脱细胞基质生物材料的方法技术

本发明专利技术涉及一种采用灌注‑压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，包括：(1)将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器，灌注消毒液同时超声振荡进行预灭菌；(2)依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液，利用渗透压差和/或液压差洗去细胞内容物、清除抗原；最终消毒灭菌、保存，即得。本发明专利技术可以显著缩短生化试剂的处理时间、降低生化试剂的使用浓度；明显提高了脱细胞基质生物材料中粘连蛋白类、生长因子类、蛋白聚糖类、糖蛋白类、葡糖胺基聚糖类等生物活性成分的保留量；同时力学强度保留好、脱细胞彻底，病毒等生物负载清除干净；工业化生产方便，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物支架材料领域，特别涉及一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法。
技术介绍
脱细胞技术制备的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分生物材料是软组织修复材料的重要发展方向。相关产品在国外被广泛的用于各种创面，如代替脑膜、胸膜、血管、骨膜、心包、关节囊等，肝脾等实质脏器破损填塞止血、吻合口加强、膀胱悬吊、盆底重建以及各种复杂疝和腹壁缺损的治疗如伴有污染的腹壁缺损、合成补片植入后感染、肠瘘二次手术治疗、造口旁疝预防等。ECM是所有组织器官的组成部分，维持着各种组织器官的三维结构和储存营养物质，支撑着细胞赖生存、活动和变化。ECM作为组织修复和再生支架材料具有较多优势：①结构和组分接近自然，生物相容性佳：ECM的主要成分包括结构蛋白(主要为I型和Ⅲ型胶原纤维，含少量Ⅳ型和Ⅵ型胶原纤维，其余部分主要为糖蛋白、纤粘蛋白、糖胺聚糖类(硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸、蛋白多糖、结合生长因子和储留水等)、生长因子与酶类(碱性成纤维细胞生成因子(bFGF)-2、转化生长因子(TGF)-β、胰岛素样生长因子(IGF)和血管内皮生长因子(VEGF)、肝脏生长因子(HGF)等)；②ECM保留“组织特异性”微环境，能够维持生长其上的细胞形态和表型、增进细胞的粘附、增殖和分化：以骨骼肌ECM为例，其ECM高IV型胶原含量(骨骼肌基底膜的主要成分)，具有复杂的、具有启动功能的三维超微结构，包括平行排列的基底膜(肌内膜管)结构、残存的神经和血管通路，利于成肌细胞粘附、迁移、激活和融合，且其降解产物对维持成肌细胞和卫星细胞的活力非常重要。③ECM有良好的可降解性和降解速率可控性，降解更符合再生规律；④ECM具有一定的孔隙率，便于组织间的营养和物质空气的交换；⑤ECM具有一定的机械强度能够对组织的生长起到支持作用。ECM材料的制备均是将取自同种、异种的组织，经脱细胞处理去除组织中的所有细胞、抗原、脂质、可溶性蛋白质等物质、保留下具有完整外观形态和组织学及超微结构的不溶性细胞外基质。ECM生物修补材料携带生物活性成分的多少将直接影响其体内重塑和修复效果。脱细胞方案十分严酷，生物活性成分将丢失殆尽(粘连蛋白、生长因子和糖胺聚糖类等生物活性成分含量保留量低于30％)，植入后仅可诱导再生出血管化的结缔组织填充组织缺损、实现解剖层面的修复。中国目前临床上已有的关于ECM材料的应用，包括替代脑膜、胸膜，盆底重建、肛瘘修补以及各种复杂疝和腹壁缺损的治疗等均属于这一水平。保留了天然ECM中40％以上的生物活性成分、低免疫原性的产品植入后则能实现组织特异性的诱导再生；如实现肌肉筋膜等组织再生和神经支配恢复而改善残疾肢体功能和断指再造，疗效肯定。因此，相关制备技术发展的方向即是彻底脱细胞的同时最大限度保留生物活性成分、并减少因材料引起的各种并发症如浆液肿、修复区失弹性等。已有的片状ECM材料的脱细胞方法一般都是化学除垢剂联合其他辅助试剂振荡法，即将片状材料置于处理液中剧烈震荡摇摆。这一方法存在较多缺点：首先，外基质生物材料如小肠粘膜下层、膀胱基质，多为致密结缔组织结构，一般的生化试剂+物理振荡的方法并不能使得试剂穿透结缔组织，试剂只能被动的处理材料表层细胞成分，无法深入具有一定厚度的组织发挥完全彻底的脱细胞作用。其次，振荡过程中极易导致片状的细胞外基质材料纠结而致使不能全部得到彻底的脱细胞处理，部分细胞外基质材料片段上的生物负载如真菌、病毒等灭活不充分，植入引起较高水平的炎症反应、降低材料重塑效果；再次，振荡洗出DNA、抗原等物质需要较长的处理时间、生物活性成分丢失多，如细胞外基质生物材料制备过程中都经历了碱处理，这一步骤虽然可用于促进材料的显著扩张(体积增加甚至达到6倍)、提高了孔隙率和表面的均匀性、降低脂质含量，但同时也几乎全部耗尽了细胞外基质中生物活性成分如生长因子、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖、蛋白聚糖等，部分厂家常在之后步骤中，再次通过喷雾、浸泡、沉浸等方法补充生物活性成分；最后，振荡工艺过程需要多次人工更换液体，分离材料，操作繁琐，所需时间较长。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，该方法可以显著缩短生化试剂的处理时间、降低生化试剂的使用浓度；明显提高了脱细胞基质生物材料中粘连蛋白类、生长因子类、蛋白聚糖类、糖蛋白类、葡糖胺基聚糖类等生物活性成分的保留量；同时力学强度保留好、脱细胞彻底，病毒等生物负载清除干净；工业化生产方便，具有良好的应用前景。本专利技术的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，包括：(1)将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器，灌注消毒液同时超声振荡进行预灭菌；(2)依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液，利用渗透压差和/或液压差洗去细胞内容物、清除抗原；最终消毒灭菌、保存，即得。所述步骤(1)中的原材料为哺乳动物(人、猪、牛、胎牛、马、羊、狗)的空腔脏器(肠、胃、膀胱)的粘膜下层或全层。所述步骤(1)中的灌注反应器为“灌注-套管机-灌注”自动脱细胞反应器。所述步骤(1)中的消毒液为醇与过氧化物、氧化性消毒剂或非氧化性消毒剂中一种或多种；预灭菌的时间为1～5小时。预灭菌处理包括单纯腔内灌注或腔内外联合灌注，灌注方式为循环或非循环灌注，消毒后PBS和去离子水交替灌注冲洗。消毒液优选为过氧乙酸(Peroxyacetic acid,PAA)/乙醇(EtOH)混合液，其中PAA的终浓度(V/V)为0.05-0.5％，乙醇的终浓度(V/V)为0.5-10％，PAA/乙醇混合液的作用时间1-5小时，优选为2-3小时，灌注速度为管腔内外液体每15分钟更新一遍。所述步骤(2)中的细胞内容物清洗液为含盐缓冲液、碱性溶液或DNA增溶性缓冲盐等溶液中一种或几种；洗去细胞内容物的时间为0.1-16小时。所述步骤(2)中的抗原封闭/清除液为离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或酶类(DNA酶、RNA酶、半乳糖苷酶)溶液中的一种或几种，如浓度0.005-0.1％的十二烷基硫酸钠或0.01-1％的Triton-X，表面活性剂处理同时可协助脱脂、进一步降低DNA含量。清除抗原的时间为0.1-16小时。所述步骤(2)中的洗去细胞内容物、清除抗原之前(之中、之后也可)还包括灌注脱脂溶剂进行脱脂处理。所述脱脂溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、氯仿中的一种或几种。步骤(2)中的灌注处理包括管腔内灌注和管腔外灌注，管腔内外流动液体的种类、压力(可内外反复交替利用液体压力差产生透壁液体交换)以及液体流向(同向或反向)均可不同。灌注方式为循环或非循环灌注，管腔内外灌注系统各自独立。管腔外液体的质量与材料的体积比≥2:1且要求材料全部浸于管腔外液体中。管腔内外液体流量要求每15分钟全部更新一遍。预灭菌消毒液、细胞内容物清洗液、抗原清除液可于管腔内外同时灌注但保持不同渗透压或液体压力，优选方案是管腔内外同时存在一定的渗透压差和液体压差，渗透压与液体压形成同方向的透壁流，在不增加被灌注腔壁力学负荷的前提下达到增加细胞内容物的灌注洗出、降低免疫原性和封闭抗原的效果。所述灌注处理管腔内外液体压力差，不超过被灌注空腔脏器的粘本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用灌注‑压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，包括：(1)将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器，灌注消毒液同时超声振荡进行预灭菌；(2)依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液，利用渗透压差和/或液体压差洗去细胞内容物、清除抗原；最终消毒灭菌、保存，即得脱细胞基质生物材料。

【技术特征摘要】
1.一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，包括：(1)将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器，灌注消毒液同时超声振荡进行预灭菌；(2)依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液，利用渗透压差和/或液体压差洗去细胞内容物、清除抗原；最终消毒灭菌、保存，即得脱细胞基质生物材料。2.根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的原材料为哺乳动物的空腔脏器。3.根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的消毒液为醇与过氧化物、氧化性消毒剂或非氧化性消毒剂中的一种或几种；预灭菌的时间为1～5小时。4.根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的细胞内容物清洗液为含盐缓冲液、碱性溶液、DNA增溶性缓冲盐溶液中的一种或几种；洗去细胞内容物的时间为0.1-16小时。5.根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的抗原封闭/清除液为离子型表面活性剂溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张剑，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，上海卓阮医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31