本发明专利技术涉及动物细菌学领域，提供了一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法，该方法以小鼠抗α毒素单克隆抗体为基础，建立了特异性高、重复性好、背景低，可直观、简便检测α毒素的Envision免疫组化方法。该方法可用于除鼠以外动物组织中产气荚膜梭菌α毒素的检测，也为该毒素在动物机体内的分布检测提供了有效、可靠的手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物细菌学领域，本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌可产生多种外毒素，根据其产生的主要4种致死性外毒素，产气荚膜梭菌分为A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)型，各型均产生α毒素，该毒素具有卵磷脂酶C和鞘磷脂酶两种毒性，可同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂成分，破坏细胞膜结构，导致细胞溶解，从而呈现细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等，在动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽等病症中起关键作用，给养殖业和公共卫生造成巨大的损失。目前，产气荚膜梭菌的检测方法主要有病原菌的分离鉴定、肠内容物的毒素检测(常用小鼠接种试验及毒素中和试验)。产气荚膜梭菌病主要是肠源性感染，常形成肠源性毒血症，并不一定形成菌血症及败血症，因此从内脏实质器官不一定能分离到细菌；而利用小鼠为实验动物做毒素接种实验和毒素中和实验时，需要针对毒素的标准阳性高免血清，耗时费力，且由于动物的个体差异，还能导致结果的不准确。免疫组织化学方法可用于研究抗原在组织器官和细胞中的定位与分布，可直观地检测到抗原物质；另外，Bacciarini指出：抗毒素抗体的免疫组化在那些细菌培养和PCR检测不可行的情况下，是一个可供选择的检测方法。α毒素是A型产气荚膜梭菌最主要的毒力因子，因此，如何运用Envision免疫组化方法检测动物组织中产气荚膜梭菌α毒素成为亟待解决的问题之一。
技术实现思路
针对现有技术的上述情况，本专利技术提供了提供了一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法，该方法以小鼠抗α毒素单克隆抗体为基础，建立了特异性高、重复性好、背景低，可直观、简便检测α毒素的Envision免疫组化方法。该方法可用于除鼠源外A型产气荚膜梭菌的检测，也为该毒素在动物机体内的分布检测提供了有效、可靠的手段。专利技术人在本专利技术中所采用的A型产气荚膜梭菌采用现有菌种，特别选自菌种NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英国国家典型培养物保藏中心，保藏号:NCTC528)，可通过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材料，不需进行单独的生物保藏。本专利技术的具体技术方案如下：具体步骤如下：1产气荚膜梭菌α毒素的制备:A型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落进行液体硫乙醇厌氧增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于产毒培养基Gordon汤中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；其中所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3.8g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5ml脱纤绵羊血。所述的产毒培养基成分为：每100mlPBS缓冲液溶解3g胰蛋白胨、1.2g糊精、2g酵母浸膏和2.2g L-精氨酸，PBS为O.01M pH7.2磷酸盐缓冲液。2人工感染家兔产气荚膜梭菌病选取1.0-1.5Kg刚断奶后家兔6只，随机分成实验组和对照组，3只/组，实验组肌肉注射上述除菌α毒素3mL，对照组注射等量的生理盐水，72h内观察动物发病状况；实验组在其死亡时，立即进行临床剖检病变，并取病变组织，投入改良Bouin’S液固定液中，用于后续的组织切片制备和免疫组化染色；对照组同时进行；所述的改良Bouin’S液固定液成分为：750mL饱和苦味酸缓冲液(由PBS缓冲液配置)，甲醛250mL，在使用前不加50mL冰乙酸；与常规Bouin’S液固定液相比，本专利技术所提供的固定液在使用前不加冰醋酸，避免了组织固定时形态收缩明显，且强酸对组织中抗原有损害，因此改良的固定液利于固定组织的长期保存。3组织切片的制备组织于固定液48h后，将组织用刀片切成1cm3的组织块，组织块经流水冲洗完固定液后，再进行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，切片于37℃温箱烤干，放置4℃备用后续免疫组化染色；阴性对照组组织同时进行此操作；4Envision免疫组化检测①阴性对照与阳性对照的组织切片于4℃冰箱拿出，在室温放置无水雾后，放置37℃温箱30min，使组织粘的更牢固，再脱蜡；②上述切片依次经二甲苯Ⅰ、Ⅱ，体积比1:1的二甲苯：100％酒精混合物，各常规脱蜡6min，再经100％酒精，95％酒精，90％酒精，80％酒精，70％酒精，蒸馏水，各水化处理4min；③上述切片在0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液90℃微波修复4次，5min/次，每次间隔4min，暴露出抗原表位，自然冷却至室温，其中所述的0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液成分为：1L去离子水、柠檬酸0.378g、柠檬酸三钠2.412g；④上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，将H2O2用PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒避光封闭1h；⑤上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，小牛血清经PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒孵育50min；⑥甩去组织上的血清，小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体F12经PBS缓冲液按体积比稀释至1/600，滴加覆盖在组织上，湿盒内孵育，4℃过夜转37℃湿盒孵育30min；⑦上述切片于经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶标二抗各试剂，37℃湿盒孵育50min；⑧上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，DAB室温下显色50-60s，切片再用去离子水充分洗涤，终止显色反应；⑨上述切片经苏木素复染1.5min，去离子水冲洗至切片不脱色；⑩1％盐酸无水乙醇溶液进行分化3s，之后切片在去离子水中冲洗返蓝15min；最后组织切片经过上行酒精脱水﹑二甲苯透明﹑中性树胶封片，显微镜观察；上述使用的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾：0.27g、磷酸氢二钠：1.42g、氯化钠：8g、氯化钾0.2g；上述方法中其他未公开参数均可参考现有技术，如2013年发表于中国兽医学报的《间接免疫酶组化检测禽波氏杆菌在感染鸡体内的抗原定位》中记载的技术方案。其中步骤(4)中小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体F12的制备方法如下：将产气荚膜梭菌α毒素的杂交瘤细胞株F12，保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.8870；进行复苏、培养；选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL/只致敏，一周后注射阳性杂交瘤细胞株F12，0.5-1×106个/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量单克隆抗体F12，腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化，SDS-PAGE检测纯化效果。5结果判定标准的确定按照普通光学显微镜视野下观察到的特定区域或细胞经染色后棕黄色显色的有无、数量、种类及深浅来判定，判定标准为：(1)没有出现棕黄色区域或细胞的判为阴性；(2)组织中棕黄色区域或细胞零星分布且少于5％的判为弱阳性；(3)组织中棕黄色区域或细胞分布比例为5％～50％为阳性；(4)组织中棕黄色区域或细胞在组织中分布比例大于50％为强阳性。采用本专利技术上述公开的检测方法，具有如下有益效果：(1)特异性强：本方法可检测到阳性对照脏器本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)产气荚膜梭菌α毒素的制备:A型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落进行液体硫乙醇厌氧增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于产毒培养基中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；(2)人工感染家兔产气荚膜梭菌病选取1.0‑1.5Kg刚断奶后家兔6只，随机分成实验组和对照组，3只/组，实验组肌肉注射上述除菌α毒素3mL，对照组注射等量的生理盐水，72h内观察动物发病状况；实验组在其死亡时，立即进行临床剖检病变，并取病变组织，投入改良Bouin’S液固定液中，用于后续的组织切片制备和免疫组化染色；对照组同时进行；(3)组织切片的制备组织于固定液48h后，将组织用刀片切成1cm3的组织块，组织块经流水冲洗完固定液后，再进行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，切片于37℃温箱烤干，放置4℃备用后续免疫组化染色；阴性对照组组织同时进行此方法操作；(4)Envision免疫组化检测①阴性对照与阳性对照的组织切片于4℃冰箱拿出，在室温放置无水雾后，放置37℃温箱30min，使组织粘的更牢固，再脱蜡；②上述切片依次经二甲苯Ⅰ、Ⅱ，体积比1:1的二甲苯：100％酒精混合物，各常规脱蜡6min，再经100％酒精，95％酒精，90％酒精，80％酒精，70％酒精，蒸馏水，各水化处理4min；③上述切片在0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液90℃微波修复4次，5min/次，每次间隔4min，暴露出抗原表位，自然冷却至室温，其中所述的0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液成分为：1L去离子水、柠檬酸0.378g、柠檬酸三钠2.412g；④上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，将H2O2用PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒避光封闭1h；⑤上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，小牛血清经PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒孵育50min；⑥甩去组织上的血清，小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体F12经PBS缓冲液按体积比稀释至1/600，滴加覆盖在组织上，湿盒内孵育，4℃过夜转37℃湿盒孵育30min；⑦上述切片于经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶标二抗各试剂，37℃湿盒孵育50min；⑧上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，DAB室温下显色50‑60s，切片再用去离子水充分洗涤，终止显色反应；⑨上述切片经苏木素复染1.5min，去离子水冲洗至切片不脱色；⑩1％盐酸无水乙醇溶液进行分化3s，之后切片在去离子水中冲洗返蓝15min；最后组织切片经过上行酒精脱水﹑二甲苯透明﹑中性树胶封片，显微镜观察；上述使用的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾：0.27g、磷酸氢二钠：1.42g、氯化钠：8g、氯化钾0.2g；结果判定标准的确定：按照普通光学显微镜视野下观察到的特定区域或细胞经染色后棕黄色显色的有无、数量、种类及深浅来判定，判定标准为：①没有出现棕黄色区域或细胞的判为阴性；②组织中棕黄色区域或细胞零星分布且少于5％的判为弱阳性；③组织中棕黄色区域或细胞分布比例为5％～50％为阳性；④组织中棕黄色区域或细胞在组织中分布比例大于50％为强阳性。...
【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)产气荚膜梭菌α毒素的制备:A型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落进行液体硫乙醇厌氧增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于产毒培养基中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；(2)人工感染家兔产气荚膜梭菌病选取1.0-1.5Kg刚断奶后家兔6只，随机分成实验组和对照组，3只/组，实验组肌肉注射上述除菌α毒素3mL，对照组注射等量的生理盐水，72h内观察动物发病状况；实验组在其死亡时，立即进行临床剖检病变，并取病变组织，投入改良Bouin’S液固定液中，用于后续的组织切片制备和免疫组化染色；对照组同时进行；(3)组织切片的制备组织于固定液48h后，将组织用刀片切成1cm3的组织块，组织块经流水冲洗完固定液后，再进行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，切片于37℃温箱烤干，放置4℃备用后续免疫组化染色；阴性对照组组织同时进行此方法操作；(4)Envision免疫组化检测①阴性对照与阳性对照的组织切片于4℃冰箱拿出，在室温放置无水雾后，放置37℃温箱30min，使组织粘的更牢固，再脱蜡；②上述切片依次经二甲苯Ⅰ、Ⅱ，体积比1:1的二甲苯：100％酒精混合物，各常规脱蜡6min，再经100％酒精，95％酒精，90％酒精，80％酒精，70％酒精，蒸馏水，各水化处理4min；③上述切片在0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液90℃微波修复4次，5min/次，每次间隔4min，暴露出抗原表位，自然冷却至室温，其中所述的0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液成分为：1L去离子水、柠檬酸0.378g、柠檬酸三钠2.412g；④上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，将H2O2用PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒避光封闭1h；⑤上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，小牛血清经PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒孵育50min；⑥甩去组织上的血清，小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体F12经PBS缓冲液按体积比稀释至1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王海荣，秦贵平，柴同杰，陈长俊，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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