精细调节的超特异性核酸杂交探针制造技术

本发明专利技术提供用于高特异性的核酸探针和引物的组合物和方法。探针系统包括互补链和保护链，以部分形成双链探针。式1所决定的探针和靶标核酸之间的杂交的反应标准自由能(ΔGorxn＝ΔGot‑TC‑ΔGonh‑PC+(ΔGov‑TC‑ΔGoh‑PC))为约‑4kcal/mol到+4kcal/mol。或者，式1所决定的探针和靶标核酸之间的杂交的反应标准自由能在式2所决定的标准自由能(‑Rτln(([P]0‑[C]0)/[C]0)])的5kcal/mol以内，式2的术语[P]0等于保护链的浓度且式2的术语[C]0等于互补链的浓度。另外，本发明专利技术提供使用本发明专利技术的探针的用于即时精细调节反应的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年12月16日提交的美国临时申请号61/916,321的优先权，其通过引用全文纳入本文。背景DNA和RNA序列中的微小差异可导致健康中的巨大差异。例如，细菌基因组中的单碱基改变可导致抗生素抗性，以及人类基因组中的一个单碱基改变可导致癌症缓解。随着基因组学领域的成熟和随之而来的许多核酸生物标志物序列和分子的发现，存在来自生物技术工业的发展可区分单碱基改变的可靠、稳健、廉价和精确的核酸试验的强烈需求。基于酶的区别核酸序列差异的方法难以与各种技术整合，因为酶要求特异性的温度和缓冲条件。确保了核酸与它们的互补物的高特异性杂交无酶技术传统上依赖于解链温度的优化，但其难以精确地预测和控制。最近，已证实粘性末端杂交探针(toehold hybridization probes)可在宽温度和盐度范围内稳健地识别核酸序列中的单碱基改变。这些探针被设计为在反应标准自由能(ΔGοrxn)接近于零的情况下与它们的预期靶标反应，从而与预期靶标的杂交率接近50％。甚至单一核苷酸造成的靶标的变化也会使其以显著较低的杂交率(中值2％)与探针结合。为了实现ΔGοrxn≈0这一性能，这些探针平衡了靶特异性的“粘性末端”区域和靶非同源性的“平衡”区域的结合能。DNA探针已经在实验上被证实可稳健地对DNA靶标进行区分，且RNA探针已经在实验上被证实可稳健地对RNA靶标进行区分。然而，这些探针被一些限制所限。例如，当探针和靶标是不同类型、如当DNA探针被设计为对RNA靶标具有特异性的、2'-O-甲基RNA探针探针被设计为与RNA靶标结合以及LNA探针被设计为特异性地与DNA靶标结合时，不同类型的核酸分子之间的杂交热力学上的差异会导致低特异性或低灵敏度的不良的探针设计。另外，单独的碱基对/堆(stacks)的热力学的结合强度相对大，尤其妨碍了反应ΔGοrxn的精细调节，其进而限制了探针系统特异性和灵敏度之间的权衡的可调节性。此外，已知已公开的DNA和RNA杂交热力学参数在某些条件下是不完全和/或错误的。计算机虚拟设计的探针系统可具有与计算而得的ΔGοrxn显著不同的真实的ΔGοrxn；没有精细调节探针性能的方法，则必须使用迭代试错来实现具有所需的ΔGοrxn的最优探针设计。专利技术概述本专利技术根据某些例子，提供了高特异性的核酸杂交探针系统，其可靠地区分靶标核酸中的单碱基改变。与现有技术相比，本专利技术描述的探针系统的优点在于(1)可靠地用DNA、RNA和其他核酸探针来探测DNA、RNA、和修饰的核酸靶标；以及(2)能够进行灵敏度和特异性之间的权衡的精细调节。本专利技术的组合物和方法可用于基于DNA和RNA探测和定量的分子癌症诊断、传染疾病诊断、食品安全诊断、和研究发现工具。在一个例子中，提供了一种用于与靶标核酸分子选择性地相互作用的组合物。该组合物包括第一浓度的包含第一区域、第二区域、和第三区域的第一核酸链、以及第二浓度的包含第四区域和第五区域的第二核酸链。靶标核酸包括第六和第七区域的核苷酸序列，其即使不完全也至少部分地分别与第一和第二区域的核苷酸序列互补。第一和第二浓度使得靶标核酸和组合物之间的相互作用具有式2(-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0)])所决定的标准自由能的5kcal/mol以内的式1[ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)]所决定的标准自由能(ΔGοrxn)，其中式2的[P]0等于第二浓度，式2的[C]0等于第一浓度，R等于通用气体常数8.314J/mol·K，τ等于开尔文温度。在该例子中，式1的ΔGοt-TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能；式1的ΔGοnh-PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能；式1的ΔGοv-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能；式1的ΔGοh-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。计算ΔGο值的方法之后在说明书中进行详述。在某些例子中，靶标核酸的浓度小于第一浓度。在另一些例子中，靶标核酸的浓度大于等于第一浓度。在另一个例子中，第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七区域的序列使得靶标核酸和组合物之间的相互作用具有式1[ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)]所决定的约-4kcal/mol到+4kcal/mol的标准自由能(ΔGοrxn)，其中[ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC]不在-1kcal/mol到+1kcal/mol之间。在另一些例子中，ΔGοt-TC和ΔGοnh-PC的值都不在彼此的10％内。在另一个例子中，靶标核酸还包括与第七区域邻近的第八区域，第八区域核苷酸序列不与第三区域核苷酸序列互补，在平衡下第八和第三区域之间的比对核苷酸对少于50％。在另一个例子中，提供一种产生核酸探针的方法。所述方法包括以下步骤：在核酸分子中选择靶标核苷酸序列，该靶标核苷酸序列包括第六核苷酸子序列和第七核苷酸子序列；选择包括第一核苷酸子序列、第二核苷酸子序列和第三核苷酸子序列的第一核苷酸序列；并选择包括第四核苷酸子序列和第五核苷酸子序列的第二核苷酸序列。在这个例子中，第一、第二和靶标核苷酸序列的步骤的选择基于具有式1[ΔGοrxn＝ΔGοt-TC-ΔGοnh-PC+(ΔGοv-TC-ΔGοh-PC)]所决定的约-4kcal/mol到约+4kcal/mol的标准自由能的相互作用，其中式1的ΔGοt-TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能，式1的ΔGοnh-PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能，式1的ΔGοv-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能，并且式1的ΔGοh-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。该方法还包括合成含有第一核苷酸序列的第一核苷酸链和含有第二核苷酸序列的第二核苷酸链的步骤。除了基于式1选择相关核苷酸序列以外，该方法可替代地或进一步包括选择第一和第二浓度，以使得式2(-Rτln(([P]0-[C]0)/[C]0))所决定的标准自由能在式1(ΔGοrxn)所决定的标准自由能的5kcal/mol以内，其中式2的[C]0和[P]0分别表示第一核苷酸链和第二核苷酸链的预定浓度，R等于通用气体常数8.314J/mol·K，且τ等于开尔文温度。在一个例子中，如果式1所决定的标准自由能不在式2所决定的标准自由能的5kcal/mol以内，则可对第一核酸链或第二核酸链中至少一个的预定浓度进行改进直至其符合该条件。或者，优化可通过重复该方法的步骤并选择改良的核苷酸序列来进行，以使其符合所需的自由能条件。提供一种用于鉴定样品中具有靶标核苷酸序列的核酸分子的存在与否或其量的方法。该方法包括将探针应用于可能含有靶标核酸分子的样品并在温度约4℃到约75℃、约25℃到约70℃、或约37℃到约65℃、或这之间的任意温度下进行杂交反应，以在靶标核酸分子存在于样品中的情况下允许探针与靶标核酸分子的杂交。在这个例子中，该探针包括第一核酸链和第二核酸链。第一核酸链含有第一区域、第二区域和第三区域，其中第一区域具有与靶标核酸分子的第六区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二区域具有与靶标核酸分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于与靶标核酸分子选择性相互作用的组合物，其特征在于，该组合物包括：第一浓度的包含第一区域、第二区域和第三区域的第一核酸链；第二浓度的包含第四区域和第五区域的第二核酸链，其中靶标核酸分子包括第六区域和第七区域；其中，第一和第二浓度使得靶标核酸和组合物之间的相互作用具有式2所决定的标准自由能的5kcal/mol以内的式1所决定的标准自由能，其中式2的术语[P]0等于第二浓度，式2的术语[C]0等于第一浓度；且其中，式1的术语ΔG°t‑TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能；术语ΔG°nh‑PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能；式1的术语ΔG°v‑TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能；式1的术语ΔG°h‑PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.16 US 61/916,3211.一种用于与靶标核酸分子选择性相互作用的组合物，其特征在于，该组合物包括：第一浓度的包含第一区域、第二区域和第三区域的第一核酸链；第二浓度的包含第四区域和第五区域的第二核酸链，其中靶标核酸分子包括第六区域和第七区域；其中，第一和第二浓度使得靶标核酸和组合物之间的相互作用具有式2所决定的标准自由能的5kcal/mol以内的式1所决定的标准自由能，其中式2的术语[P]0等于第二浓度，式2的术语[C]0等于第一浓度；且其中，式1的术语ΔG°t-TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能；术语ΔG°nh-PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能；式1的术语ΔG°v-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能；式1的术语ΔG°h-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物还包括与所述第一核酸链偶联的标记，其中该标记选自有机荧光团、半抗原、纳米粒子和放射性同位素。3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，该组合物还包括与所述第二核酸链偶联的标记，其中该标记选自有机荧光团、半抗原、纳米粒子和放射性同位素，并且用式3来代替式1。4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二浓度是所述第一浓度的约1.01倍到约10000倍。5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二浓度是所述第一浓度的约1.1倍到约1000倍。6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二浓度是所述第一浓度的约1.2倍到约100倍。7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶标核酸分子包括RNA。8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括与所述第一核酸链偶联的至少两个标记，其中所述标记相互紧邻使得第一核酸链天然昏暗。9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶标核酸分子包括DNA。10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一或第二核酸链包括选自LNA、PNA、2’-O-甲基取代的RNA、硫代磷酸酯替换的DNA或RNA L-DNA以及镜像体的合成核酸类似物。11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，ΔG°t-TC和ΔG°nh-PC的值相差大于10％，或相差大于1kcal/mol。12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一或第二核酸链包括合成或天然的核苷酸类似物，且其中合成核苷酸类似物选自肌苷、5'-硝基吲哚、甲基化核苷酸、异胞嘧啶和异鸟嘌呤、镜像体核苷酸和xDNA。13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC的值不在-1kcal/mol到+1kcal/mol之间。14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一或第二核酸链包括合成DNA。15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一或第二核酸链包括合成RNA。16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二区域与所述第四区域完全互补。17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，超过60％的所述第二区域的核苷酸与所述第四区域的比对核苷酸互补。18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二区域与所述第七区域完全互补。19.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，超过60％的所述第二区域的核苷酸与所述第七区域的比对核苷酸互补。20.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一区域与所述第六区域完全互补。21.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，超过60％的所述第一区域的核苷酸与所述第六区域的比对核苷酸互补。22.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第三区域与所述第五区域完全互补。23.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，超过60％的所述第三区域的核苷酸与所述第五区域的比对核苷酸互补。24.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，ΔG°t-TC为约-2kcal/mol到约-16kcal/mol。25.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，ΔG°t-TC为约-5kcal/mol到约-13kcal/mol。26.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，ΔG°t-TC为约-7kcal/mol到约-10kcal/mol。27.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸链和所述第二核酸链形成部分双链核酸探针。28.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，该组合物还包括超量的所述第二核酸链。29.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，在工作温度和盐度条件下计算评估的最小自由能结构中，所述第一区域中为双链状态的核苷酸少于50％。30.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸链和所述第二核酸链形成部分双链核酸引物。31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，该组合物还包括过量的所述第二核酸链，其中所诉引物在一种或多种酶的环境下使用。32.一种方法，其包括以下步骤：在核酸分子中选择靶标核苷酸序列，该靶标核苷酸序列包括第六核苷酸子序列、第七核苷酸子序列和第八核苷酸子序列；选择包括第一核苷酸子序列、第二核苷酸子序列和第三核苷酸子序列的第一核苷酸序列；选择包括第四核苷酸子序列和第五核苷酸子序列的第二核苷酸序列；使用式1计算标准自由能，其中式1的术语ΔG°t-TC表示第六区域和第一区域之间的杂交的标准自由能，式1的术语ΔG°nh-PC表示第五区域和第三区域之间的杂交的自由能，式1的术语ΔG°v-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能，且式1的术语ΔG°h-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能；并且确定使用式1计算出的标准自由能是否符合预定条件；并且如果符合预定条件，则合成包括所述第一核苷酸序列的第一核酸链和包括所述第二核苷酸序列的第二核酸链。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，还包括使用式2来计算标准自由能的步骤，其中预定条件包括处在使用式2计算的标准自由能的5kcal/mol以内，且式2的术语[C]0和[P]0分别表示所述第一核酸链和所述第二核酸链的预定浓度。34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，在式1所决定的的标准自由能不在式2所决定的标准自由能的5kcal/mol以内的情况下，则至少部分重复该方法直至式1所决定的的标准自由能在式2所决定的标准自由能的5kcal/mol以内，从而该方法还包括至少一个以下步骤：(1)选择核苷酸序列和子序列的新组；并且(2)修改所述第一核酸链或所述第二核酸链中至少一个的预定浓度。35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，预定条件包括使通过式1计算的标准自由能为约-4kcal/mol到+4kcal/mol。36.一种用于与靶标核酸分子选择性相互作用的组合物，该组合物包括：含有第一区域、第二区域和第三区域的第一核酸链，其中所述第一区域具有与所述靶标核酸分子的第六区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二区域具有与所述靶标核酸分子的第七区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列；并且含有第四区域和第五区域的第二核酸链，其中第四区域具有与所述靶标核酸分子的第二区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第五区域具有与所述靶标核酸分子的第三区域的核苷酸序列互补的核苷酸序列；其中组合物具有约-4kcal/mol到+4kcal/mol的与靶标核酸分子杂交的标准自由能，杂交的标准自由能由式1决定，式1的术语ΔG°t-TC表示第一区域和第六区域之间的杂交的标准自由能，式1的术语ΔG°nh-PC表示第三区域和第五区域之间的杂交的自由能，式1的术语ΔG°v-TC表示第七区域和第二区域之间的杂交的标准自由能，且式1的术语ΔG°h-PC表示第四区域和第二区域之间的杂交的标准自由能。37.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，包括第一浓度的所述第一核酸链和第二浓度的所述第二核酸链，其中式1所决定的靶标核酸分子的组合物的杂交的标准自由能不在约-4kcal/mol到约+4kcal\...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·Y·张，王珏皛，吴若嘉，
申请(专利权)人：威廉马歇莱思大学，
类型：发明
国别省市：美国;US