本发明专利技术提供了一株分泌鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其鉴定的TMUV‑NS1蛋白的TMUV特异性细胞表位。本发明专利技术利用TMUV NS1蛋白制备了单克隆抗体，利用单克隆抗体筛选鉴定了1个NS1蛋白的B细胞表位269DEKEIV313，该表位具有高度的保守性和特异性，可用于TMUV多肽疫苗的研制及特异性血清学方法的建立等方面。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体及其识别的B细胞表位及其应用。
技术介绍
坦布苏病毒感染(Tembusu virus，TMUV)是近年来新出现的一种以水禽感染为主的病毒性传染病。雏鸭感染后主要表现为瘫痪、倒地震颤等神经症状，产蛋鸭感染后主要表现为产蛋率下降、卵泡膜出血、卵泡破裂，形成卵黄性腹膜炎等病变特征。该病传播速度快，传播范围广，给养禽业造成了巨大的危害。TMUV属于黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群中的蚊媒类病毒，该病毒的基因组全长为10990bp，仅含有一个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码一个多聚蛋白，包括3种结构蛋白(C，prM，E)和7种非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。NS1蛋白是一种与细胞膜功能密切相关的糖蛋白，通常在感染细胞的表面表达或以细胞相关蛋白的形式存在，可能参与病毒早期的复制、装配和释放。NS1蛋白是病毒感染过程中产生的主要免疫原，含有多个T细胞和B细胞表位，在病毒感染后的免疫应答及诱导保护性免疫反应中发挥着重要作用。NS1蛋白诱导的免疫反应主要是基于NS1蛋白具有可溶性补体结合活性，可诱导产生非中和活性的免疫保护性抗体，而且该抗体不产生病毒的抗体依赖性增强作用。因此NS1蛋白是研制坦布苏病毒亚单位疫苗的重要靶抗原。目前，关于TMUV感染的防控主要是通过弱毒苗或灭活疫苗的免疫。灭活苗在使用时虽然比较安全，但也存在着抗体产生的速度慢，鸭群免疫后存在一定时期的免疫空白期，而且基本不产生体液免疫，因此该疫苗的免疫效果不如弱毒苗。弱毒苗虽然免疫效果确实，但存在散毒、毒力容易返强等缺点，有可能造成在生产实践中抵抗力较弱的鸭群出现弱毒苗感染发病的情况，给养殖业带来一定的危害。因此，通过筛选TMUV NS1蛋白的B细胞表位，研制以表位为基础的新型疫苗及特异性血清学检测方法将为临床上更好的防控该病提供重要的、有价值的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株分泌鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与TMUV NS1蛋白发生特异性反应。本专利技术的目的之三是鉴定一个TMUV-NS1蛋白的TMUV特异性细胞表位。本专利技术采用PET-28a(+)原核表达载体对TMUV NS1蛋白进行表达，将表达的蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。同时利用表达的NS1蛋白建立间接ELISA检测方法，进行杂交瘤细胞株的筛选，最终获得1株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CCTCC No.C2016104；分类命名是：小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2016.5.31；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址是：武汉市武汉大学校内。本专利技术利用原核重组表达载体表达了覆盖NS1蛋白的全长的35条16氨基酸(AA)多肽，利用针对NS1蛋白的单抗与之进行反应，通过间接ELISA筛选，获得了1个16 AA多肽表位。Western-blot和Dot-ELISA方法鉴定了该表位的特异性。为了精确定位该表位，将16 AA多肽截短，构建10个原核表达载体进行短肽蛋白的表达。表达的短肽蛋白与相应的单抗进行反应，最终获得了1个6 AA线性B细胞表位，其氨基酸序列为269DEKEIV313，Dot-ELISA对该表位进行了鉴定。同时，序列对比结果显示，该表位具有高度的保守性和特异性。综上，本专利技术利用TMUV NS1蛋白制备了单克隆抗体，利用单克隆抗体筛选鉴定了1个NS1蛋白的B细胞表位269DEKEIV313，该表位具有高度的保守性和特异性，可用于TMUV多肽疫苗的研制及特异性血清学方法的建立等方面。附图说明图1是TMUV NS1全基因扩增的电泳结果。其中M是Marker DL2000；2是阴性对照；1、3是NS1基因PCR扩增产物。图2是NS1蛋白纯化后的SDS-PAGE鉴定。其中M是蛋白质Marker；1是含pET-28-NS1的BL21(DE3)经IPTG诱导；2是纯化后的NS1蛋白。图3是单抗的Western-blot鉴定。其中M是蛋白质Marker；C是对照，载体PET-28a(+)与单抗3G2的反应；1是单抗3G2与PET-28-NS1诱导表达的蛋白发生的反应，出现大小为46kd的条带。图4是16 AA多肽蛋白的表达。其中M是蛋白质Marker；1是含空载体的BL21(DE3)诱导后；2是含16AA多肽序列原核重组表达载体的BL21(DE3)诱导后的超声波沉淀；3：含16AA原核重组表达载体的BL21(DE3)诱导后的超声波上清。图5是单抗3G2针对的B细胞表位的初步筛选。其中阳性对照为NS1蛋白的阳性血清，阴性对照未免疫小鼠的血清。图6是Western-Blot鉴定B细胞表位(16 AA)。其中M是蛋白质Marker；1是阴性对照；2是NS1-27多肽蛋白与单抗3G2反应的条带。图7是单抗3G2针对的B细胞表位的精确定位。图中展示的是NS1-27多肽序列从氨基端和羧基端截短后的短肽蛋白与单抗3G2的反应，通过间接ELISA方法，精确筛选到单抗所针对的B细胞的精确表位。图8是Dot-ELISA鉴定B细胞表位。其中A1、A2、A3、A4、A5和A7是NS1-27-F-2短肽、NS1-27-F-4短肽、NS1-27-F-6短肽、NS1-27-F-7短肽、NS1-27-F-8短肽和NS1-27-R-2短肽与单抗3G2发生阳性反应；A6、A8、A9和A10是NS1-27-F-9短肽、NS1-27-R-3短肽、NS1-27-R-4短肽和NS1-27-R-6短肽与单抗3G2不发生反应。图9是30株TMUV分离株NS1蛋白B细胞表位编码区的序列比对。其中黑点表示相同的氨基酸，鉴定的表位用矩形标注。图10是TMUV与不同黄病毒株NS1蛋白B细胞表位编码区的序列比对。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述更为清楚。这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术构成任何限制，本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。主要试验材料和来源：1.细胞、毒株和抗体TMUV-SDSG(KJ740747.1)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)均由山东农业大学动物科技学院禽病学研究室保存；BHK21细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14均购自武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；HRP标记羊抗鼠荧光二抗购自北京博奥森生物科技有限公司；羊抗鼠酶标二抗购自北京全仕金有限公司。2.主要试剂琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、质粒快速提取试剂盒、Random Premier、dNTP均购自大连宝生物工程有限公司；Trizol试剂、Taq HIFI DNA高保真扩增酶、反转录酶MLV、RNA酶抑制剂、T4 DNA连接酶、Premix Ex TaqTM kit、dd H2O等均购自北京全士金生物技术有限公司；BamHⅠ、XhoⅠ、单克隆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株分泌抗鸭坦布苏病毒(Tembusu virus)NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号为：CCTCC No.C2016104。
【技术特征摘要】
1.一株分泌抗鸭坦布苏病毒(Tembusu virus)NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号为：CCTCC No.C2016104。2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。3.由权利要求2所述单克隆...
【专利技术属性】
技术研发人员：刁有祥，提金凤，陈浩，唐熠，李志杰，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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