用于经控制DNA片段化的方法技术

本发明专利技术提供一种用于核酸的经控制活体外片段化的组合物和方法。转座酶与经修饰转座子末端形成催化活性复合物，所述经修饰转座子末端在其末端内含有序列简并、脱嘌呤/脱嘧啶位点、切口或核苷酸缺口，以在控制方法中片段化或剪切标靶核酸样品。此方法产生所需平均核酸片段尺寸。本发明专利技术组合物和方法可以应用于产生含有缩短转座子末端序列的DNA片段以促进随后反应、以便产生不对称带尾DNA片段等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2014年2月3日提交的美国临时申请第61/934,879号的优先权。在本申请中，引用各种公开、专利和/或专利申请。这些公开、专利和/或专利申请的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请中以便更充分地描述本专利技术所涉及的目前最先进的水平。
本专利技术涉及核酸的控制片段化的领域。
技术实现思路
在一些实施例中，本专利技术大体上涉及包含转座体(transpososome)复合物的组合物以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。在一些实施例中，转座体复合物包含：(i)多种转座酶，(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，以及(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸。在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。在一些实施例中，转座体复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；以及(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。任选地，转座体复合物包含两种、三种、四种或更多种转座酶。在一些实施例中，转座体复合物含于单一反应混合物中。举例来说，单一反应混合物可以含于单个反应容器中或单个孔中。在一些实施例中，可以通过进行本文中描述的任何制备转座子复合物的方法或任何活体外使DNA片段化的方法产生转座体复合物。在一些实施例中，本专利技术大体上涉及包含转座体/标靶核酸复合物的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。在一些实施例中，转座体/标靶核酸复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸；以及(iv)标靶核酸分子。在一些实施例中，标靶核酸分子包含标靶DNA分子。在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。在一些实施例中，转座体/标靶核酸复合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；以及(iv)标靶核酸分子。在一些实施例中，标靶核酸分子包含标靶DNA分子。任选地，转座体复合物包含两种、三种、四种或更多种转座酶。在一些实施例中，转座体/标靶DNA复合物可以通过进行本文中描述的任何制备转座体/标靶DNA复合物的方法或任何活体外使DNA片段化的方法来产生。在一些实施例中，本专利技术大体上涉及包含核酸片段化反应混合物的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。在一些实施例中，核酸片段化反应混合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸；(iv)标靶核酸分子；以及(v)活化阳离子。在一些实施例中，第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶。在一些实施例中，第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一或第二转座子末端序列缺乏修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列具有相同或不同序列。在一些实施例中，活化剂包括镁和/或锰的一种或任何组合。在一些实施例中，核酸片段化反应混合物包含：(i)多种转座酶；(ii)含有第一转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第一转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第一转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iii)含有第二转座子末端序列的多核苷酸，其中所述第二转座子末端序列能够结合到多种转座酶并且其中所述第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点；(iv)标靶核酸分子；以及(v)活化阳离子(例如镁或锰)。在一些实施例中，标靶核酸分子包含标靶DNA分子。在一些实施例中，核酸片段化反应混合物进一步包含缓冲剂(例如Tris-HCl)、碱金属(例如NaCl和/或KCl)、清洁剂(例如TritonX-100、TritonX-114、NP-40、Brij、Tween-20、SDS或CHAPS)以及活化阳离子(例如镁或锰)。任选地，核酸片段化反应混合物缺乏任何活化阳离子(例如镁或锰)。举例来说，活化阳离子包括为转座酶所需用于催化转座反应的任何阳离子。在一些实施例中，核酸片段化反应混合物缺乏活化阳离子(或含有极低含量的活化阳离子)。在一些实施例中，本专利技术大体上涉及包含片段化核酸分子的组合物，以及相关方法、系统、试剂盒以及设备。在一些实施例中，片段化核酸分子包含：(i)接合到第一转座子末端序列的DNA分子的第一端，和(ii)接合到第二转座子末端序列的DNA分子的第二端。在一些实施例中，第一转座子末端序列包括至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第二转座子末端序列包括至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。在一些实施例中，第一和第二转座子末端序列含有至少一种修饰，包括损伤，例如切口、缺口、脱嘌呤位点或脱嘧啶位点。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于经控制DNA片段化的活体外方法，所述方法包含(a)使形成包含以下的转座体复合物的转座子和转座酶与标靶DNA接触，第一转座子，其具有可经所述转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列，和第二转座子，其具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列，形成反应混合物，其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自由以下组成的群组的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口、核苷酸缺口，以及其组合；和b)在用于转座反应的条件下培育所述反应混合物，产生标靶DNA片段，和将所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列、或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列并入到所述标靶DNA的至少一个5′端中，其中相对于未经修饰的转座子末端序列，转座酶对含有所述修饰的所述第一、第二或第一和第二转座子末端序列的亲和力降低，产生经控制DNA片段化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.03 US 61/934,8791.一种用于经控制DNA片段化的活体外方法，所述方法包含(a)使形成包含以下的转座体复合物的转座子和转座酶与标靶DNA接触，第一转座子，其具有可经所述转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列，和第二转座子，其具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列，形成反应混合物，其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自由以下组成的群组的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口、核苷酸缺口，以及其组合；和b)在用于转座反应的条件下培育所述反应混合物，产生标靶DNA片段，和将所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列、或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列并入到所述标靶DNA的至少一个5′端中，其中相对于未经修饰的转座子末端序列，转座酶对含有所述修饰的所述第一、第二或第一和第二转座子末端序列的亲和力降低，产生经控制DNA片段化。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含(c)在不存在补平或接合衔接子的情况下，在扩增反应中使用与所述标靶DNA片段的所述5′端中的转座子末端的第二部分互补的第一和第二寡核苷酸引物扩增所述片段化标靶DNA。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二引物任选地包含5′衔接子尾部。4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含(c)将衔接子补平和/或接合到所述标靶DNA片段的至少一端，其中补平产生钝端或A-突出端，并且其中接合添加钝端或粘性末端衔接子。5.根据权利要求1所述的方法，其中当所述修饰包含所述核苷酸缺口或切口时，由所述修饰界定并且并入到所述标靶DNA中的所述转座子末端的一部分在所述转座反应之后或在随后扩增反应之后或期间自所述标靶DNA崩解，其中所述转座子末端的所述部分自所述标靶DNA片段崩解增强所述标靶DNA片段的扩增效率，和/或产生不对称带尾标靶DNA片段。6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含使包含在所述5′端的所述转座子末端的所述标靶DNA片段与具有5′-3′核酸外切酶或链置换活性的DNA聚合酶接触，由所述标靶DNA片段产生完全双链DNA的步骤。7.根据权利要求1所述的方法，其产生长度是100bp到2000bp的标靶DNA片段。8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含通过以下中的一个将所得标靶DNA片段的bp长度改变为预定平均长度：(a)改变转座子复合物的量，(b)改变所述反应复合物中标靶DNA的量，或(c)改变所述转座反应的培育时间。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座子末端选自Mu转座子末端、Mos1转座子末端、哈氏弧菌(Vibrio harvey)转座子末端和/或Tn5转座子末端。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述转座酶选自MuA转座酶、Mos1转座酶、哈氏弧菌转座酶或Tn5转座酶。11.根据权利要求1所述的方法，其使用Mu转座子末端和MuA转座酶。12.根据权利要求1所述的方法，其使用Mos1转座子末端和Mos1转座酶。13.根据权利要求1所述的方法，其使用Tn5转座子末端和Tn5转座酶。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰序列是在始于3′转座子末端的第6、第8、第10、第14、第16、第18、第19或第27核苷酸位置处的切口，并且在一个链的相邻核苷酸之间不存在磷酸二酯键。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰序列是在至少一个链的序列中的1、2或3个核苷酸的缺口。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱嘌呤位点或脱嘧啶位点分别包含选自甲基化碱基、无碱基位点和尿嘧啶的非嘌呤和非嘧啶核苷酸。17.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和/或所述第二寡核苷酸引物的所述5′衔接子尾部包含选自由以下组成的群组的标签：扩增标签、测序标签、检测标签以及其组合。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一和所述第二寡核苷酸引物的所述衔接子尾部包含测序标签，并且所述方法进一步包含使来自(c)的扩增产物变性以产生单链DNA；将所述单链DNA粘接到固体载体，所述固体载体涂布有与所述测序标签互补的寡核苷酸；以及使用固定到所述固体载体的所述单链DNA作为模板将DNA测序。19.根据权利要求5所述的方法，其使得待测序的转座子DNA的量最小化。20.根据权利要求1所述的方法，其使得产生所需标靶DNA片段长度。21.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：具有可经转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列的第一转座子，和具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列的第二转座子，并且其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自以下的引入的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤/脱嘧啶位点、切口和/或核苷酸缺口。22.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有切口；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含切口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有切口，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有切口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有切口。23.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有缺口；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含缺口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有缺口，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有缺口，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有缺口。24.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有脱嘌呤位点；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含脱嘌呤位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有脱嘌呤位点，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有脱嘌呤位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有脱嘌呤。25.一种转座体复合物，其包含以下的双链转座子：第一转座子，其具有第一转座子核苷酸末端序列，所述第一转座子核苷酸末端序列可经转座酶识别并且含有脱嘧啶位点；和第二转座子，其具有第二转座子核苷酸末端序列，所述第二转座子核苷酸末端序列可经所述转座酶识别并且如果所述第一转座子核苷酸末端序列不含脱嘧啶位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列含有脱嘧啶位点，或如果所述第一转座子核苷酸末端序列含有脱嘧啶位点，那么所述第二转座子核苷酸末端序列任选地含有脱嘧啶位点。26.一种试剂盒，其包含形成包含以下的转座子复合物的转座子和转座酶：具有可经转座酶识别的第一转座子核苷酸末端序列的第一转座子，和具有可经所述转座酶识别的第二转座子核苷酸末端序列的第二转座子，其中所述第一转座子末端序列、所述第二转座子末端序列或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列包含选自由以下组成的群组的经修饰序列：简并序列、脱嘌呤位点、脱嘧啶位点、切口、核苷酸缺口以及其组合；和使用所述转座子复合物产生平均预定DNA片段长度的DNA库的说明书。27.一种试剂盒，其包含形成如权利要求21到25中任一权利要求所述的转座体复合物的转座子和转座酶。28.一种用于经控制DNA剪切以获得平...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·乌卡尼斯，A·卢比斯，R·塔莫谢维丘什，E·盖达毛斯卡斯，
申请(专利权)人：赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司，
类型：发明
国别省市：立陶宛;LT