一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，包括脂肪细胞诱导分化后用hoechst33258工作液对细胞核染色，测定吸光度值；胞核染色后用PBS清洗，用尼罗红工作液对胞内脂滴进行染色，测定吸光度值；定义一个新的用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值，用于反应单位细胞分化程度；在荧光显微镜下对胞核和脂滴进行观察、拍照，并用Image‑Pro Plus软件merge胞核和脂滴图片，用于评估脂肪细胞分化程度。本发明专利技术使用细胞总数对尼罗红OD值进行校正，消除由于细胞数目不同或细胞不均带来的误差；操作方法简单、准确度高、杂质少。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养
，尤其涉及一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法。
技术介绍
研究动物前体脂肪细胞分化机制对于人类脂肪代谢紊乱性疾病治疗具有重要意义。在体外，动物前脂肪细胞可以经鸡尾酒法(胰岛素、地塞米松、IBMX)诱导分化最终形成成熟脂肪细胞，这一过程中，细胞胞质中甘油三脂不断合成并逐渐积聚形成圆形脂滴。通过脂滴的数量和积聚程度可以评估前体脂肪细胞分化程度。目前，一般使用亲脂染料染色并萃取检测吸光度的方法对成熟脂肪细胞中的脂滴进行定量和定性。油红O可以将成熟脂肪细胞中的脂滴染成红色，同时，用异丙醇萃取后检测吸光度可以对甘油三酯的多少进行量化。因此，一直以来油红O染色被认为是一种经典的脂滴染色方法。但随着细胞实验技术的快速发展，实验精度的要求也越来越高，经典的油红O染色法也暴露出了自身的一些缺陷，如：①染色时细胞需要固定和反复清洗，时间长且易破坏细胞层；②油红O工作液在使用前需要过滤，否则染色后会出现油红残渣，影响观察；③染色后不易将多余染液洗尽，导致异丙醇萃取后检测出来的吸光度偏高；④饱和油红O液体保存太久颜色会变得深黑，影响使用；⑤在长时间操作过程中，挥发的异丙醇会影响实验者的健康。另外，用荧光染料尼罗红染色检测吸光度值也可以用于定量脂滴的数量，相较油红O萃取法更加方便可行。尼罗红或油红O测定的吸光度值反应的是细胞总体的分化程度，适用于细胞数目相同的情况，然而实际实验中，很难保证在分化成熟后不同实验组间细胞数目仍然相同，吸光度值高可能是分化程度高，也可能是细胞数目多而分化程度一般，只能说明甘油三脂总体含量多。因此，仅仅通过吸光度值来判断细胞分化程度的高低是不够全面的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，旨在解决通过吸光度值来判断细胞分化程度的高低是不够全面的问题。本专利技术是这样实现的，一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，所述评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值，用于反应单位细胞分化程度。进一步，所述定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之前需要：步骤一，脂肪细胞诱导分化后用hoechst33258工作液对细胞核进行染色，并测定吸光度值；步骤二，胞核染色后用PBS清洗，再用尼罗红工作液对胞内脂滴进行染色，并测定吸光度值。进一步包括：第一步，前脂肪细胞分化，将孔板从培养箱取出，吸去培养液，PBS清洗两次；第二步，清洗后，每孔加入对应体积的hoechst33258工作液，20-25℃避光孵育10min；第三步，弃染液，用PBS轻缓清洗一次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝352nm/461nm,检测荧光强度；第四步，弃去染液并用PBS清洗两次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液，20-25℃避光孵育5min；第五步，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝485nm/572nm,检测荧光强度；第六步，将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核和脂滴进行观察并拍照。进一步，所述定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之后需要：在荧光显微镜下对胞核和脂滴进行观察、拍照，并用Image-Pro Plus软件merge胞核和脂滴图片，用于评估脂肪细胞分化程度。本专利技术提供的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，本专利技术定义一个新的用于评估脂肪细胞分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst 33258的OD值。尼罗红OD值反应总的甘油三脂多少，Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，hoechst 33258的OD值反应细胞的数量。校正尼罗红OD值排除分化成熟后试验组间细胞数目的差异，用于反应单位细胞分化程度。同时，使用Image-Pro Plus软件merge同一视野的胞核和脂滴图片，比传统的油红O染色图片更能够直观观察脂滴分布和细胞分布，并结合校正尼罗红OD值来评估脂肪细胞分化程度。本专利技术操作方法简单、准确度高、简单易行、杂质少，更易于用户观察，可以在短时间内对前体脂肪细胞分化程度进行精确评估。因此，此专利技术更适用于当前脂肪细胞分化的工作。本专利技术提供一种快速精确评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法。该方法操作简易、准确度高、耗时少、重复性好，能够有效反应脂肪细胞分化程度，为前体脂肪细胞分化研究提供有效的检测方法。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术使用hoechst33258染液。hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。比经典的苏木精染色更加方便快捷，容易操作，且杂质少，便于观察。同时用hoechst33258染色后可以测定吸光度值，直接反应细胞数目。2)本专利技术使用尼罗红工作液对脂滴进行染色。与经典的油红O染色法相比，尼罗红染色不用固定细胞、且杂质少、染色时间短，同时使用尼罗红的OD值可以避免油红O萃取法未清洗干净或萃取不够带来的假阳性和假阴性结果，方便快捷，准确度较高。3)本专利技术定义一个新的用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值。尼罗红OD值反应总的甘油三 脂多少，Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，hoechst 33258的OD值反应细胞的数量。校正尼罗红OD值排除分化成熟后试验组间细胞数目的差异，用于反应单位细胞分化程度。与传统的油红O萃取法和测定总尼罗红OD值法相比，使用hoechst33258的OD值校正可以排除分化后细胞数目的差异，避免假阴性和假阳性的干扰，更能够客观反应脂肪细胞真实的分化程度。4)本专利技术使用Image-Pro Plus软件merge同一视野的胞核和脂滴图片，比传统的油红O染色图片更能够直观观察脂滴分布和细胞分布。附图说明图1是本专利技术实施例提供的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的不同时间点3T3-L1诱导分化尼罗红OD值示意图。图3是本专利技术实施例提供的不同时间点3T3-L1诱导分化校正尼罗红OD值示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法包括以下步骤：S101：前脂肪细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板取出培养箱，小心吸去培养液，PBS清洗两次，注意不要损坏底层细胞；S102：清洗后，每孔加入相应体积的hoechst33258工作液(见表1)，室温(20-25℃)避光孵育5min；S103：弃染液，用PBS轻缓清洗一次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝352nm/461nm,检测荧光强度；S104：弃去多余染液并用PBS轻缓清洗两次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液(见表1)，室温(20-25℃)避光孵育5min；S105：将孔板置于荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，所述评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值，用于反应单位细胞分化程度。

【技术特征摘要】
1.一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，所述评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值，用于反应单位细胞分化程度。2.如权利要求1所述的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，所述定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之前需要：步骤一，脂肪细胞诱导分化后用hoechst33258工作液对细胞核进行染色，并测定吸光度值；步骤二，胞核染色后用PBS清洗，再用尼罗红工作液对胞内脂滴进行染色，并测定吸光度值。3.如权利要求2所述的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，进一步包括：第一步，前脂肪细胞分化，将孔板从培养箱取出，吸去培养液，PBS清洗两次；第二步，清洗后，每孔加入对应体积的ho...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进威，马继登，李明洲，李学伟，龙科任，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51