本发明专利技术公开了一种用于扩增覆盖襀翅目昆虫线粒体全基因组的长片段的通用引物，该通用引物由两对引物组成，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。采用本发明专利技术的通用引物，可以有效地扩增出多种襀翅目物种线粒体基因组的长片段，有助于缩短获取分子数据的周期，为我国襀翅目昆虫的系统发育研究提供了重要工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及两对用于扩增襀翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物。
技术介绍
襀翅目(Plecoptera)又称石蝇，该类昆虫较广泛地分布在多种类型的水域中，是重要的水质监测指标生物，加强该类群的分类研究，可以更好地为水质环境监测提供服务。从系统学和进化学的角度来看，襀翅目是一个关键的类群。虽然襀翅目系统发育被广泛研究，但仍需要通过其他更多的特征来证明。而通过分子手段获得的资料将更有助于推断襀翅目各科间的亲缘关系以及和其他目的亲缘关系。深入了解襀翅目昆虫的起源、进化和系统发育关系，对重建襀翅目系统发育乃至研究昆虫纲的进化关系都具有重要意义。这就需要借助快速而准确的分子手段对襀翅目昆虫进行相关领域的研究。近年来，随着分子技术和高通量技术的快速发展，线粒体基因组已成为区分物种和研究物种进化关系的热点研究对象。因此，利用线粒体基因组对襀翅目昆虫进行系统发育分析是一种较好的方法。目前，昆虫遗传研究过程中，小规模线粒体基因组研究的主流方法仍然是传统的基于PCR扩增产物的引物步移法。该方法使用的引物数量较多、扩增效率低、对模版纯度要求高、耗时长，并且缺少足够的特异性，这将阻碍昆虫线粒体基因组分子数据的快速积累，并对某些昆虫如对襀翅目昆虫的系统发育研究造成困难。目前国际上没有专门针对扩增襀翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物的相关报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种襀翅目昆虫线粒体基因组长片段扩增的通用引物，它能满足现有技术的上述需求。一种用于扩增襀翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物，由两对引物组其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。本专利技术还公开了一种襀翅目昆虫线粒体基因组长片段的扩增方法，是采用上述的引物，用25μl PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。所述的25μl PCR体系是：5μl 10×buffer(+Mg2+)，2.5μl dNTP(2.5mM)，3μl上游引物(20μM)，3μl下游引物(20μM)，0.2μl TaKaRa LA Taq酶(5U/μl)，1μl DNA模板(30ng/μl)，10.3μl双蒸水。所述的PCR扩增条件是：93℃预变性2min；92℃变性10s，54℃退火30s，68℃延伸8min，扩增20个循环；之后92℃变性10s，54℃退火30s，68℃延伸8min，且每一循环增加20s，扩增20个循环；最后68℃延伸7min。本专利技术根据昆虫纲昆虫的线粒体基因组存在保守区域的特性，通过比对Genbank中不同目昆虫的线粒体基因组序列设计出扩增引物。采用本专利技术的襀翅目线粒体基因组长片段扩增引物，可以有效地扩增出襀翅目不同科物种的长片段序列，填补了襀翅目长片段没有通用的扩增引物的空白，对襀翅目不同科和属的昆虫进行大规模的长片段测序，将产物直接进行高通量测序，有效缩短分子数据的获取周期，为我国襀翅目昆虫的系统发育和种群遗传结构研究提供了重要工具。本专利技术涉及的扩增引物较过去传统方法有较大的优势，具体表现为：本引物能有效扩增出总长近16000bp的长片段，完全覆盖线粒体基因组全长，而过去的传统方法有效扩增长度一般为1000bp左右，且扩增效率低，不利于上述研究的数据分析。利用本引物对襀翅目昆虫进行大规模的系统发育进化分析，能显著降低实验成本，缩短实验周期，提高实验的准确性。附图说明图1是本专利技术引物对襀翅目4科昆虫线粒体长片段的扩增效果图。1-2为钩襀；3-4为扁襀；5-6为绿襀；7-8为刺襀；M为Marker。图2是实验过程中其它引物对襀翅目4科昆虫线粒体长片段的扩增效果图。1-2为钩襀；3-4为扁襀；5-6为绿襀；7-8为刺襀；M为Marker。具体实施方式本专利技术的襀翅目线粒体基因组长片段的扩增引物筛选方法共分两个步骤：1.以Genbank中测得的不同目昆虫的线粒体基因组序列为基础，通过比对找出相对保守的序列片段进行引物设计，同时引入简并位点增加引物通用性；2.将合成的引物对襀翅目昆虫线粒体基因组进行扩增，检测其在襀翅目中的通用性和扩增效率；3.在过程中曾设计出多对引物，经实验结果验证表明本专利技术的引物最优。下面结合实例对专利技术做进一步说明：1.样品准备：样品均使用存放于扬州大学应用昆虫研究所标本室内存放于100％酒精的襀翅目不同科的昆虫，包括钩襀科、扁襀科、绿襀科、刺襀科等科的襀翅目昆虫。2.DNA提取：Axygen试剂盒提取DNA，具体步骤参照说明书。3.数据来源：数据来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI,http:/www.ncbi.nlm.gov/)。4.序列比对：利用ClustalX软件将不同目昆虫的线粒体基因组全序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列区域。5.引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer Premier 5在碱基变异度最小的序列区域设计出2对引物。引物序列为Au:5’CGAGCWTACTTTACTTCAGCMACWATAATTA3’(SEQ ID NO.1)；Ad:5’GCAAATARRAARTATCATTCATTCTGGTTGGAT 3’(SEQ ID NO.2)；Bu:5’TACACCAAACAGGATCAAATAAYCCMWTAGG 3’(SEQ ID NO.3)；Bd:5’GCTCCACARATTTCTRCATTGACCAAARAA3’(SEQ ID NO.4)。6.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的样本。7.扩增结果检测：扩增引物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物可以有效地扩增襀翅目昆虫的线粒体长片段。利用这2对引物扩增出的DNA片段总长度约为16000bp，覆盖襀翅目昆虫线粒体基因组(全长为16000bp左右)，且琼脂糖凝胶电泳检测条带较为单一(图1)；而当使用其它引物时，电泳检测条带则大量弥散，效果较差(图2)。因此，本专利技术引物可以有效地扩增出襀翅目不同科物种的线粒体基因组长片段，且测序结果较准确。8.引物扩增条件：上述引物25μl PCR体系为：5μl 10×buffer(+Mg2+)，2.5μl dNTP(2.5mM)，3μl上游引物(20μM)，3μl下游引物(20μM)，0.2μl TaKaRa LATaq酶(5U/μl)，1μl DNA模板(30ng/μl)，10.3μl双蒸水。本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于扩增襀翅目昆虫线粒体全基因组长片段的通用引物，其特征在于，由两对引物组成，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.用于扩增襀翅目昆虫线粒体全基因组长片段的通用引物，其特征在于，由两对引物组成，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。2.一种襀翅目昆虫线粒体全基因组序列的扩增方法，其特征是采用权利要求1所述的通用引物，用25μl PCR体系在PCR扩增条件下进行目标片段扩增。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的25μl PCR体系是：5μl添加Mg2+的10×buffer，2.5μl...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜予州，陈志腾，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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