本发明专利技术提供一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β‑内酰胺酶的方法，β‑内酰胺酶抗原40U/mL包被酶标板，0.8mg/ml的Rabbit Anti‑LACTB按体积比1:800稀释，包被，体积分数5％BSA封闭酶标板，加待测样品，设阴性对照，100ug/ml的β‑lactamase‑Antibody按体积比1:3000稀释，孵育；1mg/ml羊抗鼠lgG‑HRP体积比1:5000稀释加入，孵育；TMB单组份显色液显色；终止反应，测OD450nm，通过待测样品平均OD值与阴性对照组OD值比判定样品中β‑内酰胺酶浓度阴性或阳性。该方法具有检测速度快、灵敏度高、操作简单等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及β-内酰胺酶的检测方法，具体是一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β-内酰胺酶的方法。
技术介绍
β-内酰胺酶可以裂解牛奶中青霉素、头孢菌素类抗生素，使这些类抗生素在牛奶中减少或者去除，所以又被称为“解抗剂”。青霉素、头孢菌素类抗生素等被β-内酰胺酶裂解后生成青霉噻唑酸等，青霉素噻唑酸与蛋白质结合成青霉噻唑蛋白，它是引起青霉素过敏的主要物质之一，从而使有过敏体质的人出现皮肤瘙痒、呼吸困难等症状。2009年，我国卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食品用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第二批)》，其中就含有β-内酰胺酶。目前，国内外对β-内酰胺酶的检测方法研究还处于初始阶段，牛乳中β-内酰胺酶的检测方法有：杯碟法、碘量法、酸度定量法、高效液相色谱法等，但这些方法存在耗时长，假阴性和假阳性现象，成本高等缺点，而双抗体夹心酶联免疫法可以有效的检测抗原，具有检测速度快、灵敏度高、操作简单等优点。因此，本实验利用Rabbit Anti-LACTB和β-lactamase-Antibody(8A5.A10)建立双抗体夹心ELISA检测方法，为β-内酰胺酶的检测及有管部门提供了快速有效的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β-内酰胺酶的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：双抗体夹心法具体操作是一种基于抗原抗体反应检测抗原的技术，将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后加入待测抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，通过酶标仪测定OD值从而判断抗原的含量。具体步骤为：1)包被β-内酰胺酶抗原：β-内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔100μL，4℃过夜，次日洗板；2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜，次日洗板；3)封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育2h，洗板；4)加样：加入待测样品，同时设阴性对照，每孔100μL，每份样品至少加双孔，37℃孵育1h，洗板；5)加单克隆抗体：浓度为100ug/ml的β-lactamase-Antibody按β-lactamase-Antibody:PBS缓冲液体积比1:3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版,每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；6)加酶标二抗：加入羊抗鼠lgG-HRP，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100μL，室温下避光显色约15min；8)终止反应:每孔加入终止液50μL终止反应，于终止反应后20min内测定实验结果。9)测定OD450nm：用酶标仪测定450nm的OD值当P/N≥2.1时，判定样品为阳性，当P/N＜2.1时，判定样品为阴性，其中P为待测样品平均OD值，N为阴性对照组OD值，P/N＝2.1时β-内酰胺酶浓度为25U/ml。上述洗板为：弃去酶标板中剩余液体，用洗涤液250μL/孔洗涤酶标板，每孔洗涤3次，每次3-5min，在滤纸上拍干；所述封闭液为体积分数5％BSA、体积分数7.5％BSA、体积分数2.5％BSA、质量分数5％脱脂奶粉、体积分数1％BSA、质量分数1％脱脂奶粉中的一种或二种以上，所述洗涤液为pH7.4,，0.15M的PBS；所述终止液为2M H2SO4。所述β-内酰胺酶抗原包被浓度为40U/mL，为用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶从200U/mL稀释到40U/mL所得。所述的酶标二抗为将1mg/ml的羊抗鼠lgG-HRP用PBS缓冲液按羊抗鼠lgG-HRP:PBS缓冲液体积比1:5000稀释所得。所述的封闭液优选为体积分数5％BSA。所述TMB单组份显色液主要成分是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。本专利技术对双抗体夹心ELISA法进行优化，分别对多克隆抗体的包被时间和稀释倍数，单克隆抗体稀释倍数，酶标抗体孵育时间与稀释浓度的确定，封闭液条件，底物作用时间等进行选择,根据实验条件选择最佳条件。实验得出抗体包被时间不能太短，时间太短抗体与酶标板结合会不是很稳固，影响实验结果，所以本实验采用4℃过夜，pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液作为包被液，加强结合能力。而且单克隆抗体和酶标二抗进行稀释倍数优化，选择最佳的稀释倍数用于试验，排除由于单克隆抗体和酶标二抗浓度不适造成的不确定因素。还需要对封闭时间和底物作用时间进行测定，从而确定最佳反应条件，经重复性评价，证明本专利技术提供的方法重复性良好，本方法检测最低浓度为25U/mL，因此本专利技术建立了稳定的双抗体夹心ELISA检测方法。附图说明图1抗原最佳浓度的曲线；图2多克隆抗体和单克隆抗体工作浓度的选择；图3酶标抗体工作条件的选择；图4封闭液的选择；图5封闭时间的选择；图6底物作用时间的选择；具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1 最佳工作条件的确定：(1)β-内酰胺酶抗原最佳包被浓度的确定：采用棋盘方阵的方法，按图1所示组合进行试验：1)包被β-内酰胺酶抗原：用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶从200U/mL稀释包被于酶标板上(稀释浓度梯度为30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL)，每孔100μL，4℃过夜，次日洗板；2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜，次日洗板；3)封闭：用5％BSA封闭液封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育2h，洗板；4)加样：用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液将β-内酰胺酶稀释到200U/mL替代实施例1中的待测样品，同时设阴性对照(磷酸盐缓冲液)，每孔100μL，每份样品加5孔，37℃孵育1h，洗板；5)加单克隆抗体：浓度为100ug/ml的β-lactamase-Antibody按β-lactamase-Antibody:PBS缓冲液体积比1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1：2500、1:3000、1:3500的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版,每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；6)加酶标二抗：将1mg/ml的羊抗鼠lgG-HRP用PBS缓冲液按羊抗鼠lgG-HRP:PBS缓冲液体积比1:5000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100μL，室温下避光显色约15min；8)终止反应:每孔加入2M H2SO4终止液50μL终止反应，于终止反应后20min内测定实验结果。9)测定OD450nm：用酶标仪测定450nm的OD值，选择接近1，对照阴性值小于0.2，P/N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β‑内酰胺酶的方法，其步骤如下：1)包被β‑内酰胺酶抗原：β‑内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔100μL，4℃过夜，次日洗板；2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti‑LACTB按Rabbit Anti‑LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜，次日洗板；3)封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育2h，洗板；4)加样：加入待测样品，同时设阴性对照，每孔100μL，每份样品至少加双孔，37℃孵育1h，洗板；5)加单克隆抗体：浓度为100ug/ml的β‑lactamase‑Antibody按β‑lactamase‑Antibody:PBS缓冲液体积比1:3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版,每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；6)加酶标二抗：加入羊抗鼠lgG‑HRP，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100μL，室温下避光显色约15min；8)终止反应:每孔加入终止液50μL终止反应，于终止反应后20min内测定实验结果；9)测定OD450nm：用酶标仪测定450nm的OD值，当P/N≥2.1时，判定样品为阳性，当P/N＜2.1时，判定样品为阴性，其中P为待测样品平均OD值，N为阴性对照组OD值，P/N＝2.1时β‑内酰胺酶浓度为25U/ml，为本方法最低检测浓度；上述洗板为：弃去酶标板中剩余液体，用洗涤液250μL/孔洗涤酶标板，每孔洗涤3次，每次3‑5min，在滤纸上拍干。...
【技术特征摘要】
1.一种优化的用双抗体夹心ELISA法检测β-内酰胺酶的方法，其步骤如下：1)包被β-内酰胺酶抗原：β-内酰胺酶抗原包被于酶标板上，每孔100μL，4℃过夜，次日洗板；2)包被多克隆抗体：将浓度为0.8mg/ml的Rabbit Anti-LACTB按Rabbit Anti-LACTB:碳酸盐缓冲液体积比1:800的比例进行稀释，稀释后的溶液100μL/孔包被酶标板，4℃孵育过夜，次日洗板；3)封闭：用封闭液封闭酶标板，每孔200μL，37℃孵育2h，洗板；4)加样：加入待测样品，同时设阴性对照，每孔100μL，每份样品至少加双孔，37℃孵育1h，洗板；5)加单克隆抗体：浓度为100ug/ml的β-lactamase-Antibody按β-lactamase-Antibody:PBS缓冲液体积比1:3000的比例进行稀释，稀释后的溶液加入酶标版,每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；6)加酶标二抗：加入羊抗鼠lgG-HRP，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板；7)显色：向酶标板中加入TMB单组份显色液，每孔100μL，室温下避光显色约15min；8)终止反应:每孔加入终止液50μL终止反应，于终止反应后20m...
【专利技术属性】
技术研发人员：于国萍，邵美丽，岳崇慧，吴昊，藏小丹，范美婧，陈媛，陈超，王艳菲，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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