一种一步法检测降钙素原的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种一步法检测人血清中降钙素原含量的试剂盒及其制备方法。本检测试剂盒采用一步夹心法反应原理，所述试剂盒包括：校准品、酶结合物、包被板、发光底物液、浓缩洗涤液，其中，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗PCT单克隆抗体，所述包被板为将抗PCT单克隆抗体包被在固相载体表面。本发明专利技术提供一种方便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确范围广且能在90分钟内得到检测结果且成本低等优点。本发明专利技术提供的PCT检测试剂盒，它仪器兼容性强，检测成本低，弥补了临床上对PCT检测产品的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外诊断试剂领域，具体地，本专利技术涉及一种用化学发光法检测人血清中降钙素原含量的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
降钙素原(PCT)由116个氨基酸组成，分子量大约为12.7KD。PCT由神经内分泌细胞(包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞)表达，经酶切分解为(未成熟)降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血中仅含有少量的PCT。细菌感染后PCT会明显升高。动物模型试验显示机体发生脓毒血症时，多组织均能表达PCT。脓毒血症患者体内的PCT只含有114个氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro。PCT水平升高见于细菌性脓毒血症，尤其是重症脓毒血症和感染性休克。PCT可作为脓毒血症的预后指标，也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标。对于社区获得性呼吸道感染和空调诱导性肺炎患者，PCT可作为抗生素选择以及疗效判断的指标。健康人的血浆PCT质量浓度低于0.05ng/ml。老年人、慢性疾病患者、以及不足10％的健康人血浆PCT质量浓度高于0.05ng/ml，最高可达0.1ng/ml，但一般不超过0.3ng/ml。脓毒症患者PCT的诊断界值为超过0.5ng/ml，严重脓毒症和脓毒性休克患者PCT质量浓度波动在5～500ng/ml之间。极少数严重感染患者血浆PCT水平超过1000ng/ml。人降钙素原(PCT)是人降钙素的前体物，无激素活性，其在健康人血清中水平极低，但在全身性细菌感染患者血清中含量迅速升高，感染后两个小时即可检测到，且持续时间长，其在血清中的水平与感染性疾病的严重程度呈正相关，经有效抗生素治疗后，PCT水平可迅速下降，而病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、外伤(多创伤或手术创伤)、临床用药、慢性炎症以及局部感染者，PCT水平维持在正常范围内或者有轻度升高。因此，PCT是细菌感染所致重症全身性炎症反应的良好指标，在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测降钙素原(PCT)的试剂盒。本专利技术所提供的检测试剂盒采用一步夹心法反应原理，并结合化学发光免疫技术。试剂盒包括校准品、酶结合物、包被板、发光底物液、浓缩洗涤液。其中，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗PCT单克隆抗体。所述包被板为将抗PCT单克隆抗体包被在固相载体表面。本专利技术的技术方案为采用2株抗PCT单克隆抗体，首先将一株PCT单克隆抗体包被于固相载体表面，在微孔板各孔中分别加入校准品或血清样品后，再加入酶标记另一株PCT单克隆抗体，温育后即形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。充分洗涤后加入化学发光底物液，其发光强度与PCT浓度成正比。测定时，先洗去包被板中的液体，再加入发光底物液，其发光强度与PCT浓度成正比。测定每孔发光值(RLU)，以各校准品发光值(RLU)的对数(需减去S0的发光值)为纵坐标(Y轴)，各校准品浓度的对数为横坐标(X轴)作图，得到标准曲线。样品中PCT浓度可从标准曲线上查出。本专利技术的另一个目的是提供一种如上述的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1.校准品配制：用组分为0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐缓冲液，体积比为2～20％新生牛血清和0.1％～1％Proclin-300标准稀释液将PCT抗原原料稀释至0.2～50ng/ml，4℃保存备用，为校准品。2.酶结合物的配制：HRP与抗PCT单克隆抗体的连接选用改良过碘酸钠氧化法。此方法是在pH4～6的条件下，用高碘酸钠直接将HRP分子上的羟基氧化成醛基形成醛化酶，加入乙二醇以中和NaIO4。此醛基与抗体分子的氨基形成Schiff碱，再加入NaBH4还原，形成稳定的酶-抗体结合物。而后采用0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐缓冲液，体积比为2～20％新生牛血清、0.1％～1％Proclin-300和0.1％～0.5％食品红缓冲液将酶-抗体结合物按照1∶1000～1∶10000的体积比稀释，4℃保存备用，为酶结合物。3.包被板的制备：选用0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐作包被缓冲液，将抗PCT单克隆抗体按2～10μg/ml稀释，加入微孔板中，100μl～200μl/孔，2～8℃过夜包被后甩去包被液，加入封闭液100μl～200μl/孔，2～8℃过夜封闭，以封闭板孔壁上的空白位点，然后甩去封闭液，扣干、室温吹干，为包被板。4.发光底物液的配制：为2～10mmol/L过氧化氢，2～10mmol/L Luminol，2～10mmol/L p-iodopHenol，10～100mmol/L pH 7.0～9.6的Tris-HCL缓冲液。5.浓缩洗涤液的配制：为0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐，质量比为10～20％的NaCl并含0.2～2％Tween20的缓冲液。本专利技术的试剂盒，具有操作简便，仅需一步温育反应即可，灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、范围广、能在90分钟内得到检测结果且成本低等优点。其应用价值在于：(1)对败血症做早期诊断；(2)对系统性的严重细菌感染(腹膜炎或软组织感染等)做早期诊断；(3)对败血症和SIRS作鉴别诊断；(4)细菌感染和非细菌性炎症反应(自身免疫性疾病等)的鉴别诊断；(5)细菌感染和病毒感染的鉴别诊断(脑脊膜炎等)；(6)器官移植术后鉴别诊断(细菌感染、病毒感染、吸收热、排斥反应、真菌感染等)；(7)对不明原因发烧(UFO)的诊断及对特殊感染高危患者(重症监护室、器官移植术后、免疫抑制期)监测；(8)脓毒性休克和非脓毒性休克的鉴别诊断。本专利技术提供一种方便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确范围广的PCT检测试剂盒，该试剂盒仪器兼容性强，检测成本低，弥补了临床上对PCT产品的需求。附图说明图1.A批试剂盒log-log线性图，经回归分析：y＝0.937x+4.572；R2＝0.997。图2.B批试剂盒log-log线性图，经回归分析：y＝0.946x+4.571；R2＝0.998。图3.C批试剂盒log-log线性图，经回归分析：y＝0.946x+4.571；R2＝0.998。具体实施方式下面结合附图，详细说明本专利技术的实施操作，但本专利技术请求保护的技术方案不受限于下述实施方式，在不改变其要点的情况下，可做各种改变进行实施。其中实施例中使用的试剂，如果没有特别说明，在满足实验要求的情况下，均购自试剂公司。实施例1试剂盒制备工艺试剂盒制备过程包括以下步骤：(一)校准品的配制1.配制组分为浓度为0.01～0.05M pH7.0～9.6的磷酸盐，体积比为2～20％新生牛血清和0.1％～1％Proclin-300的校准品稀释液。2.将PCT抗原原料稀释至0.2～50ng/ml范围内的各浓度点，为校准品。3.按照0.5ml/瓶分装，2～8℃保存备用。(二)酶结合物的配制；1.PCT单克隆抗体的标记：HRP与抗PCT单克隆抗体的连接选用改良过碘酸钠氧化法，形成稳定的酶-抗体结合物。2.将标记好的酶-抗体结合物按1∶1000～1∶10000的体积比加入到配方为0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐缓冲液，体积比为2～20％新生牛血清、0.1％～1％Proclin-300本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一步法检测降钙素原(PCT)的试剂盒，其特征在于，本检测试剂盒采用一步夹心法反应原理，并结合化学发光免疫技术，所述试剂盒包括：校准品、酶结合物、包被板、发光底物液、浓缩洗涤液，其中，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗PCT单克隆抗体，所述包被板为将抗PCT单克隆抗体包被在固相载体表面。

【技术特征摘要】
1.一种一步法检测降钙素原(PCT)的试剂盒，其特征在于，本检测试剂盒采用一步夹心法反应原理，并结合化学发光免疫技术，所述试剂盒包括：校准品、酶结合物、包被板、发光底物液、浓缩洗涤液，其中，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗PCT单克隆抗体，所述包被板为将抗PCT单克隆抗体包被在固相载体表面。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品是采用0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐缓冲液，体积比为2～20％新生牛血清和0.1％～1％proclin-300的标准稀释液将PCT抗原稀释至0.2～50ng/ml制备得到。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶结合物采用0.01～0.05M pH为7.0～9.6的磷酸盐缓冲液，体积比为2～20％新生牛血清，0.1％～1％Proclin-300和0.1％～0.5％食品红缓冲液将酶-抗体结合物按照1∶1000～1∶10000的体积比稀释制备得到。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦伟涛，郑嘉庚，曾玲，王学前，李玉彬，张旭东，潘国华，谷泽亮，
申请(专利权)人：北京北方生物技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11