本发明专利技术提供一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由多房棘球蚴的表面抗原Emy162以及黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基(CTB)构成。本发明专利技术主要通过基因合成技术合成多房棘球蚴表面抗原Emy162基因序列，然后将该基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌原核表达系统表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得多房棘球蚴亚单位疫苗。该多房棘球蚴亚单位疫苗能够诱发机体产生针对多房棘球蚴T细胞及B细胞免疫应答和高滴度特异性抗体体液免疫应答，可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及到一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗的设计制备方法和应用。
技术介绍
多房棘球蚴（Alveolar Echinococcosis）导致泡型棘球蚴病，多房棘球蚴在中间宿主肝内以出芽的方式生长或浸润式增殖，产生新囊泡，长入肝组织，囊壁外角皮层很薄且常不完整，囊体与周围组织间无明显界限，囊液持续渗漏可与肝组织接触，引起局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死,，晚期似肝癌样转移能转移至肺、脑、乳腺等脏器，素有“虫癌”之称，预后极差。世界范围内北半球高海拔地区为泡型棘球蚴病的高发区域。我国三江源地区是多房棘球蚴病的世界罕见高发地区。多房棘球蚴病具有发病范围广、恶性程度高、早期诊断难、预后效果差、术后易复发等特点。目前针对多房棘球蚴病尚无令人满意的治疗策略。大多数牧区患者出现症状时才就医，而病情往往已至晚期，丧失手术机会，即使进行肝部分或半叶切除，术后复发率也很高。甲苯达唑、 阿苯达唑等抗生素疗法有一定的治疗效果，但是由于需长期连续治疗导致耐药性的出现及治疗后复发率高等缺限。表面抗原是刺激机体产生免疫应答的基本功能单位，很多表面抗原可以用作疫苗的研发。而亚单位疫苗基于表面抗原而制备，具有独特的疫苗设计思路，是研制预防和治疗感染性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等疫苗的新方向。亚单位疫苗具有以下优点：（1）亚单位疫苗减少或消除了常规活疫苗或灭活疫苗难以去除的热原、变应原及其它有害的反应原；且由于亚单位疫苗不能在体内复制, 对宿主没有致病风险, 是最具安全性和稳定性的一种基因工程疫苗。（2）亚单位疫苗只含有病原体的一种或几种只产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，而不含有病原体其他遗传信息，故不含有感染性组分，因而无须灭活，也无致病性，具有很好的稳定性。（3）亚单位疫苗可采用大肠杆菌、酵母菌等原核表达系统进行表达。故亚单位疫苗产量很高，易纯化，便于工业化生产。在多房棘球蚴疫苗研究领域，亚单位疫苗与其他疫苗相比，同样具有很大优势，既可激发更高特异性的抗多房棘球蚴抗体，又可防止疫苗免疫引起的一些自身免疫性疾病，具有更高的免疫针对性和安全性。对于多房棘球蚴抗原的寻找一直是当前研究的热点之一，现阶段包虫病研究主要集中在包虫病诊断抗原，对预防、抑制多房棘球蚴感染的抗原研究还较少；加之多房棘球蚴感染宿主的免疫逃逸机制复杂，目前还未形成对多房棘球蚴的免疫治疗方式。研究发现Emy162具有很强的免疫作用，并稳定表达于棘球蚴生命周期的各阶段（原头节、培养的棘球蚴、未成熟成虫与成熟成虫），在棘球蚴的粘附及运动生理学中发挥重要的作用。本课题拟将多房棘球蚴的表面抗原Emy162与黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基进行基因融合，经原核系统表达纯化得到亚单位疫苗CTB-Emy162，免疫BALB/C小鼠，使用脾淋巴细胞增殖、特异性ELISA等方法确证亚单位疫苗的免疫原性及免疫特异性。本专利技术的思路如下：根据机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制，筛选出具有良好免疫原性的多房棘球蚴表面抗原Emy-162，利用分子生物学技术与黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基（CTB）相偶联，设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162。利用小鼠脾淋巴细胞增殖、ELISA等多种免疫学方法检测多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162的免疫原性和免疫特异性。研究表明多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162能够激发BALB/c小鼠产生的T细胞、B细胞免疫应答和有效抑制多房棘球蚴活性的高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面是提供了一种新型多房棘球蚴亚单位疫苗。本专利技术的第二个方面是提供了多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法。本专利技术的第三个方面是公布了多房棘球蚴亚单位疫苗的用途。本专利技术的第一个方面是提供了一种针对多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162。该多房棘球蚴亚单位疫苗主要由Emy162和霍乱毒素B亚基构成，多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162的整体氨基酸序列如（序列1）所示，表面抗原Emy162的氨基酸序列如（序列3）所示。本专利技术的新型多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162具有以下优点：（1）Emy162是多房棘球蚴表面抗原，被公认为是多房棘球蚴疫苗的理想候选抗原能够取得良好的保护作用。多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162能够引起 T细胞及B细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答。（3）Emy162抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本专利技术的多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162采取“偶联分子内免疫佐剂”的设计思路来增强表面抗原Emy162的免疫原性，从而诱发高滴度的特异性抗体产生。本专利技术的第二个方面是提供多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：（1）新型多房棘球蚴亚单位疫苗抗原分子的结构设计根据机体对多房棘球蚴的免疫保护性机制，合理选择具有良好免疫原性的多房棘球蚴表面抗原Emy-162，并与黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚基（CTB）相偶联，设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162。（2）重组表达质粒pET28a-CTB-Emy162（含有融合基因CTB-Emy162）的构建首先构建一个含有霍乱毒素B亚基（CTB）基因的重组表达载体pET-CTB；然后通过基因合成技术合成一个多房棘球蚴表面抗原Emy162的核苷酸序列，并将其插入重组表达载体pET-CTB中，构建重组表达载体pET28a-CTB-Emy162。（3）融合蛋白CTB-Emy162的原核表达及纯化将重组表达载体pET28a-CTB-Emy162转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组基因工程菌株BL21(DE3)/ pET28a-CTB-Emy162。利用IPTG诱导表达，并通过Ni-NTA镍离子亲和层析能够获得高纯度融合蛋白CTB-Emy162，即为多房棘球蚴亚单位疫苗。本专利技术的第三个方面是提供了多房棘球蚴亚单位疫苗的用途。多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。附图说明图1：新型多房棘球蚴亚单位疫苗的分子结构设计特点。图2：Emy162基因PCR结果图。泳道1：DNA Marker；泳道2为Emy162 DNA片段经PCR后的结果图3：重组表达载体pET28a-CTB-Emy162的双酶切鉴定。泳道1：DNA Marker；泳道2：pET28a-CTB-Emy162质粒经Nco I和 Xho I双酶切后图4：重组表达载体pET28a-CTB-Emy162质粒图谱。Nco I和Xho I之间为插入的融合基因CTB-Emy162图5：多房棘球蚴融合蛋白CTB-Emy162的原核表达。泳道1：BL21(DE3)/ pET-28a全菌蛋白；泳道2：蛋白质Marker；泳道3：BL21(DE3)/ pET-28a-CTB-Emy162全菌蛋白；泳道4：BL21(DE3)/ pET-28a- CTB-Emy162可溶蛋白；泳道5：BL21(DE3)/CTB-Emy162包涵体蛋白。图6:多房棘球蚴融合蛋白CTB-Emy162的Ni-NTA亲和层析纯化。泳道1：纯化前的CTB- Emy162蛋白样品；泳道2：经Ni-NTA纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多房棘球蚴亚单位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基（CTB）和棘球蚴表面抗原Emy162构成，其氨基酸序列如序列1所示。
【技术特征摘要】
1.一种多房棘球蚴亚单位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基（CTB）和棘球蚴表面抗原Emy162构成，其氨基酸序列如序列1所示。2.如权利要求1所述，一种多房棘球蚴亚单位疫苗CTB-Emy162，其核苷酸序列如序列2所示。3.一种多房棘球蚴表面抗原Emy162的氨基酸序列如序列3所示。4.如权利要求3所述，多房棘球蚴表面抗原Emy162的核苷酸序列如序列4所示。5.包含权利要求2和4中所述的核苷酸序列的表达载体，转基因细胞系及宿主菌。6.如权利要求1所述，霍乱毒素B亚基（CTB）和多房棘球蚴表面抗原Emy162之间的间隔序列为DPRVPSS。7.一种多房棘球蚴亚单位疫苗...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊海宁，格日力，阳旦才让，汤锋，周虎，李润乐，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海;63
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